超高效液相色谱-串联质谱法检测水果中6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂及其质谱裂解规律

周 瑶, 杨惠琴, 时逸吟, 陈佳娴, 朱 坚, 邓晓军, 郭德华

(上海出入境检验检疫局, 上海 200135)

研究论文

超高效液相色谱-串联质谱法检测水果中6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂及其质谱裂解规律

周 瑶*, 杨惠琴, 时逸吟, 陈佳娴, 朱 坚, 邓晓军, 郭德华

(上海出入境检验检疫局, 上海 200135)

建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定橙子、香蕉、苹果、菠萝中E-苯氧菌胺、嘧菌酯、醚菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯和肟菌酯6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的方法。采用计算机辅助谱图解析软件ACD Lab/MS Fragmenter对质谱裂解路径进行了分析。样品经乙腈提取,氨基固相萃取柱(SupelClean LC-NH2)净化,采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)进行分离,以含0.1%(v/v)甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液和含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,在电喷雾正离子模式下,采用多反应监测(MRM)模式监测,外标法定量。结果显示,6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在5～100 μg/L(其中吡唑醚菌酯在1～20 μg/L)范围内的相关系数(r2)均大于0.999。6种杀菌剂的加标回收率为60.4%～120%,相对标准偏差(RSD)为2.15%～15.1%(n=6)。该法能满足橙子、香蕉、苹果和菠萝中6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量的检测要求。

超高效液相色谱-串联质谱;固相萃取;计算机辅助谱图解析软件;甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂;水果

杀菌剂是近年来发展最快,使用最多的一类农药,自2007年以来已经超越杀虫剂位居农药市场第二位,而甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂则在杀菌剂使用中占据主导地位。从近几年全球甲氧基丙烯酸酯类农药的销售额以及农药单位面积施用量来看,排在前三位的药物分别为嘧菌酯(azoxystrobin)、吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)以及肟菌酯(trifloxystrobin)[1]。为防止该类药物的滥用,中国、美国和欧盟等多个国家和组织机构都制定了农产品中该类药物的残留限量[2-4],其中中国和美国对于吡唑醚菌酯的限量相对严苛,对香蕉中该物质的限量分别为0.02 mg/kg和0.04 mg/kg;美国对于肟菌酯限量涉及的基质种类最为广泛,有10余种水果基质,并规定了其他水果最大限量不得超过5 mg/kg;中国、美国和欧盟对于多数水果中该类化合物的使用限量为0.2～20 mg/kg。

目前,对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的多残留检测方法主要有气相色谱-质谱法[5]、液相色谱-大气压化学电离(APCI)源-串联质谱法[6]、液相色谱-电喷雾电离(ESI)源-串联质谱法[7]。甲氧基丙烯酸酯的裂解机理较为复杂，采用不同的电离模式所选择的监控离子碎片也不相同,因此目前未见关于其裂解路径的报道。本研究结合了计算机辅助图谱解析软件ACD Lab/MS Fragmenter验证了可能的分子碎片结构，建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测橙子、香蕉、苹果和菠萝中E-苯氧菌胺(E-metominostrobin)、嘧菌酯、醚菌酯(kresoxim-methyl)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、吡唑醚菌酯和肟菌酯6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的分析方法。

1 实验部分

1.1仪器、试剂与材料

ACQUITYTM超高效液相色谱仪、Waters XevoTMTQ-S三重四极杆串联质谱仪(美国Waters公司); PT 2500E均质器(瑞士Kinematica公司); 5810R台式离心机(德国Eppendorf公司); RE800水浴旋转蒸发仪(日本Yamato公司); Elmasonic P超声波清洗机(德国Elma公司); KMC-1300V涡旋混合器(韩国Vision公司); LP620P电子天平(德国Sartorius公司); GC-12A氮吹仪(美国Ameritech公司); Milli-Q超纯水发生器(美国Millipore公司); SupelClean LC-NH2固相萃取柱(500 mg/3 mL,美国Supelco公司)。

氯化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);乙酸乙酯(HPLC级,上海安谱实验科技股份有限公司);甲醇和乙腈(HPLC级,上海星可高纯溶剂有限公司);甲苯(HPLC级,美国Thermo Fisher Scientific公司)。其他试剂均为国产色谱纯。

标准品:E-苯氧菌胺、嘧菌酯、醚菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯和肟菌酯纯度均大于99.0%(德国Dr. Ehrenstorfer公司)。分别称取适量的6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂标准品10 mg,用乙腈溶解并定容至10 mL,配制质量浓度为1 000 mg/L的单标准储备液,于4 ℃冰箱内避光储存;分别吸取适量单标准储备液,用乙腈逐级稀释,配制所需浓度的混合标准工作溶液。

试样:根据国家质检总局食品化妆品标准化技术委员会发布的《食品化妆品专业化学分析方法验证程序》[8]对典型水果基质的分类,从上海口岸日常监控水果样中挑选了4种水果典型基质:橙子(高酸、高含水量柑橘类)、香蕉(低水分、低脂肪、高淀粉或高蛋白类)、苹果(高含水量仁果类)和菠萝(高酸、高含水量其他类)。

1.2样品前处理

1.2.1提取

称取5.0 g经均质后的样品于50 mL塑料离心管中,加入5 mL乙腈,用涡旋混匀器振荡1 min,加入5.0 g氯化钠,振荡1 min,以4 000 r/min离心5 min,移取上层清液,用乙腈定容至10 mL。移取5 mL定容后的溶液至旋转蒸发瓶中,于30 ℃水浴中旋转蒸发至近干,用氮气吹至全干后,用1.0 mL乙腈溶解,待净化。

1.2.2净化

将氨基固相萃取柱固定在固相萃取装置上,用4 mL乙腈活化,准确吸取400 μL待净化液上样,用6 mL乙腈-甲苯(7∶3, v/v)洗脱,洗脱液全部转移至旋转蒸发瓶中(温度为30 ℃)蒸发至近干,再用氮气吹干,用1 mL乙腈-水(1∶1, v/v)定容后,过0.22 μm有机滤膜,待UPLC-MS/MS分析。

1.3仪器条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美国Waters公司);柱温:室温;流动相A:含0.1%(v/v)甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液;流动相B:含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱程序:0～1.50 min, 10%B～40%B; 1.50～2.50 min, 40%B; 2.50～4.00 min, 40%B～90%B; 4.00～5.00 min, 90%B; 5.00～5.01 min, 90%B～10%B; 5.01～6.50 min, 10%B。流速:0.25 mL/min;进样量:1 μL。6种待测物的保留时间见表1。

离子源:ESI源,正离子模式;离子源温度：150 ℃;毛细管电压:0.5 kV;脱溶剂温度:650 ℃;锥孔气流速:150 L/h;监测模式:多反应监测(MRM)模式。6种待测物的监测离子对、锥孔电压、碰撞能量等参数见表1。

表 1 6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的保留时间和质谱参数Table 1 Retention times and MS parameters of the six strobilurin fungicides

CAS: chemical abstracts service; * quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1质谱条件的优化

取质量浓度均为100 μg/L的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂混合标准溶液,在ESI+模式下进行母离子扫描,确定准分子离子峰[M+H]+;调节锥孔电压、毛细管电压等参数后进行子离子扫描,优化碰撞能量;每个化合物选择2个子离子,以响应值较高的子离子作为定量离子,另一个作为辅助定性离子。优化后的质谱参数见表1。

2.2二级碎片裂解路径

图 1 6种目标化合物的子离子扫描质谱图及其可能的裂解途径Fig. 1 Product ion spectra and probable fragmentation routes of the six target compounds

图 1 (续)Fig. 1 (Continued)

图 1 (续)Fig. 1 (Continued)

图 1 (续)Fig. 1 (Continued)

甲氧基丙烯酸酯类化合物共同的结构单元是E-β-甲氧基丙烯酸酯类单元,在α-位与分子的其余部分相连,通常其活性基团有:甲氧基丙烯酸类、甲氧基氨基甲酸酯类、肟基乙酸酯类、肟基乙酰胺类、唑烷二酮类、咪唑啉酮类。甲氧基丙烯酸酯类化合物结构中变化较多的是侧链,且侧链大多在活性基团的邻位。侧链结构中多含有芳氧基、杂芳氧基、芳氧烷基和杂芳氧烷基等,有的还在侧链中引入氟原子、氯原子和三氟甲基等吸电子基团以优化活性。在电喷雾正离子模式下E-苯氧菌胺、嘧菌酯、醚菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯和肟菌酯的一级质谱均可获得稳定的[M+H]+峰。通过手动调节碰撞能量,获得6种化合物的子离子全扫描质谱图(见图1)。由于甲氧基丙烯酸酯类化合物中活性位点较多,其二级裂解机理较为复杂,目前未见关于这6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的裂解路径及碎片结构的报道,且现有的液相色谱-串联质谱法给出的选择监控离子也各不相同。本研究采用计算机辅助谱图解析技术软件(ACD/MS Fragmenter)进行分析,在软件的参数选项中选择“正模式大气压电离(APCI, ESI电离模式)”以及常见反应中的“芳烃键断裂反应”“成环反应”“共振反应”“氢原子转移反应”选项,模拟解析得到6种化合物可能获得的碎片离子,并通过与实际二级质谱中优化获得的子离子进行比较,选择更为合理的监控离子。6种化合物可能的碎片离子结构及裂解路径见图1。对于E-苯氧菌胺,其中一个稳定的碎片离子通过丢失自由基和中性小分子[M+H-CH3-C6H4]+获得,另一个碎片离子则通过断裂一侧支链获得。对于嘧菌酯(m/z404.1>372.0>329.1)、啶氧菌酯(m/z368.1>205.1>145.1)以及吡唑醚菌酯(m/z388.1>194.1>163.1),当施加一定碰撞能量后,首先生成一个主要的稳定碎片离子,随着碰撞能量的增强,该碎片离子继续裂解成另一个稳定的碎片离子。对于醚菌酯,存在由同一个活性中心点附近,通过丢失不同的碎片,生成相对分子质量非常接近的碎片离子,比如对于m/z314.1>267.1来说,可能是[M+H-CH4-HNO]+或[M+H-CH3-CH4O]+,因此在二级质谱图上也可以看到m/z为267.1和267.3的两个碎片离子。肟菌酯的裂解途径则是通过一侧与氮原子相连的α碳处发生断裂(m/z409.1>145.0),一侧由活性中心点氮原子处直接断裂(m/z409.1>186.1)。通过计算机辅助谱图解析软件,可以更好地分析碎片离子的合理性。

2.3色谱条件的优化

采用正离子模式进行质谱检测时,通常使用具有一定酸度的流动相进行分离,使被分析物更容易质子化而带正电荷,从而提高检测的灵敏度。本研究以含0.1%(v/v)甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液和含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液为流动相,并对流动相的比例和梯度洗脱程序进行优化。结果表明,采用1.3节所述的梯度洗脱程序时，6种甲氧基丙烯酸酯可得到较好的峰形和分离效果,目标化合物附近无干扰峰。6种甲氧基丙烯酸酯混合标准溶液(5 μg/L)在MRM模式下的色谱图见图2。

图 2 6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂混合标准溶液(5 μg/L)在MRM模式下的色谱图Fig. 2 Chromatograms of the mixed standard solution (5 μg/L) of the six strobilurin fugicides in MRM mode

2.4前处理条件的优化

2.4.1提取溶剂的选择

本研究比较了针对农药残留常用的提取溶剂乙腈和乙酸乙酯对水果基质中目标分析物的提取效率。采用添加法制备农药含量为0.1 mg/kg的加标样品,分别采用乙腈和乙酸乙酯提取。结果表明,采用乙腈作为提取溶剂时,目标化合物的回收率较采用乙酸乙酯提取时高,尤其对于香蕉基质。因此本研究选择乙腈作为提取溶剂。

2.4.2上样体积和洗脱液体积的选择

由于甲氧基丙烯酸酯类的分子结构中含有具有N、O、F原子的吸电子基团,化合物极性较强,根据文献[6,7],本方法选择氨基固相萃取柱对6种化合物进行净化和富集,并采用乙酸乙酯-甲苯(7∶3, v/v)溶液进行洗脱。本方法对上样体积和洗脱液体积进行了优化。

为了确定固相萃取净化过程中的上样体积,将质量为100 ng的标准品分别溶解于1、2.5和5 mL的乙腈中,然后按1.2.2节的操作进行活化和上样,并对上样后的流出液进行收集和分析。结果表明,当上样体积为1 mL时,收集的流出液中未测得任何目标化合物,说明该体积条件下,目标化合物均富集在固相萃取柱上;当上样体积为2.5 mL时,流出液中有40%的目标化合物;当上样体积为5 mL时,流出液中有55%的目标化合物。因此,本方法将上样体积设为1 mL以下，以保证目标化合物不会流出。

图 3 洗脱液体积对6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂回收率的影响Fig. 3 Effects of elution volumes on the recoveries of the six strobilurin fugicides

以100 μg/L混合标准工作液为研究对象，按1.2.2节所述进行净化，洗脱液体积设为10 mL，每2 mL收集一次并分析(见图3)。结果表明,6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在氨基柱上的洗脱行为基本一致,所有化合物在6 mL洗脱体积下均已被洗脱完全,因此本方法将洗脱液体积设为6 mL。

图 4 水浴温度对香蕉中6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂回收率的影响Fig. 4 Effects of bath temperatures on the recoveries of the six strobilurin fugicides in banana

2.4.3水浴温度的选择

在提取和净化步骤中,均需要用到水浴旋转蒸发装置对目标化合物进行浓缩,本研究比较了水浴温度为30 ℃和50 ℃时,空白香蕉基质中目标化合物的回收率(见图4)。可以看出,水浴温度为30 ℃时,6种目标化合物的回收率均高于50 ℃下的回收率。因此本方法确定水浴温度为30 ℃。

由于净化过程中使用的洗脱液为乙酸乙酯-甲苯(7∶3, v/v)溶液,而最后定容溶剂为乙腈-水(1∶1, v/v)溶液,两种溶剂的互溶性较差。6种甲氧基丙烯酸酯类化合物的结构中均含有苯环,更易溶于乙酸乙酯-甲苯(7∶3, v/v)溶液,因此,对洗脱液进行浓缩时必须浓缩至全干后再用乙腈-水(1∶1, v/v)溶液复溶,否则会导致回收率显著降低。

2.5标准工作溶液的稳定性考察

用乙腈配制质量浓度为100 μg/L的混合标准工作液,分为6份,分别装入2 mL进样瓶中,密封,置于4 ℃冰箱内保存,每隔7 d分析其中的一份，并用当日新配制的100 μg/L标准溶液进行校准(见表2)。结果表明,除E-苯氧菌胺、嘧菌酯外,其余4种化合物在15 d时均发生了不同程度的降解。因此,对于100 μg/L的甲氧基丙烯酸酯类混合标准工作液,4 ℃冷藏条件下的保存时间不应超过7 d。

表 2 甲氧基丙烯酸酯类混合标准工作液(100 μg/L) 的稳定性考察Table 2 Stability of strobilurin mixed standard working solutions (100 μg/L)

表 4 6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 4 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the six strobilurin fungicides

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.6方法学验证

2.6.1基质效应

采用液相色谱-质谱进行检测时,由于基质效应(ME)的影响,可导致目标化合物发生离子增强或抑制作用[9]。本实验通过分析添加6种化合物的混合标准溶液(10 μg/L)的不同空白基质样品溶液,考察了不同基质中的基质效应,通过3次平行进样,对其峰面积进行归一化处理,最终得到ME=(AMatrix/AS)×100%,其中AMatrix和AS分别为基质标准溶液和溶剂标准溶液的峰面积。结果表明,6种化合物在橙子、香蕉、苹果、菠萝4种水果基质中的基质效应为94.9%～111.4%(见表3)，说明基质效应作用不显著，可忽略。

表 3 6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在不同水果中的基质效应Table 3 Matrix effects of the six strobilurin fungicides in different fruits

2.6.2线性关系、检出限和定量限

配制质量浓度为5～100 μg/L的混合标准工作液(吡唑醚菌酯为1～20 μg/L),以定量离子的峰面积为纵坐标(Y)、相应的质量浓度为横坐标(X, μg/L)绘制标准曲线。在各自的线性范围内,定量离子的峰面积和样品质量浓度间的线性关系良好,相关系数(r2)>0.999(见表4)。采用在空白基质中添加目标化合物的方法,以定性离子色谱峰的信噪比(S/N)=3计算方法的检出限,以S/N=10计算方法的定量限。各类杀菌剂的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限见表4。

2.6.3回收率和日内精密度

分别称取5.0 g橙子、香蕉、苹果、菠萝，将其作为基质样品,分别添加100.0、50.0和10.0 μg/kg的标准品,其中吡唑醚菌酯的添加水平为20.0、10.0和2.0 μg/kg,进行加标回收试验,每个加标水平平行测定6次。6种目标化合物的加标回收率为60.4%～120%,相对标准偏差为2.15%～15.1%(见表5),满足国家质检总局食品化妆品标准化技术委员会发布的《食品化妆品专业化学分析方法验证程序》[8]中关于方法回收率及相对标准偏差的要求。

2.7实际样品分析

采用本方法对市场上购买的不同批次的橙子、苹果、香蕉和菠萝进行了检测。结果表明，只在其中1个香蕉样本中检测出了189 μg/kg的醚菌酯,其他化合物的含量均在检出限以下。

表 5 6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在不同水果基质中的加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 5 Recoveries and RSDs of the six strobilurins fungicides spiked in different fruits (n=6)

3 结论

本方法通过计算机辅助谱图解析软件确定合理的监测离子,建立了超高效液相色谱-串联质谱测定水果中6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的方法。样品经乙腈提取,氨基固相萃取柱净化,UPLC-MS/MS电喷雾正离子多反应监测(MRM)模式检测,外标法定量。方法操作简单,测定结果准确可靠,重复性好。

[1] Zhang Y B. World Pesticides, 2016, 38(4): 30

张一宾. 世界农药, 2016, 38(4): 30

[2] GB 2763-2014

[3] US Environmental Protection Agency (EPA), EPA Office of Pesticide Programs. Index to Pesticide Chemical Names, Part 180 Tolerance Information, and Food and Feed Commodities (by Commodity). (2012-12-12) [2017-07-12]. http://www.access.gpo.gov/nara/cfr/waisidx_07/40cfrv23_07.html

[4] EC/149/2008

[5] Bo H B, Wang J H, Guo C H, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2008, 36(11): 1471

薄海波, 王金花, 郭春海, 等. 分析化学, 2008, 36(11): 1471

[6] Wang Y F, Ge B K, Gao J H, et al. Food Research and Development, 2009, 30(4): 130

王云凤, 葛宝坤, 高建会, 等. 食品研究与开发, 2009, 30(4): 130

[7] Zhang Y L, Huang C Q, Zhu X Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(3): 264

张育乐, 黄超群, 朱晓雨, 等. 色谱, 2013, 31(3): 264

[8] Certification and Accreditation Administration of the People’s Republic of China, Notification of Certification and Accreditation Administration of the People’s Republic of China (CNCA) on Carrying out the Pilot Work of Verification of Industrial Standard Method on Food and Cosmetics. (2016-04-08) [2017-07-12]. http://www.cnca.gov.cn/xxgk/gwxx/gwxx2012/201210/t20121024_49258.shtml

中国国家认证认可监督管理委员会. 国家认监委关于组织开展食品专业化学分析方法类行业标准验证试点工作的通知. (2016-04-08) [2017-07-12]. http://www.cnca.gov.cn/xxgk/gwxx/gwxx2012/201210/t20121024_49258.shtml

[9] Li Y, Xu D M, Yi X H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(4): 398

李优, 徐敦明, 伊雄海, 等. 色谱, 2017, 35(4): 398

Determination of strobilurin fungicides in fruits and their mass fragmentation routes by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHOU Yao*, YANG Huiqin, SHI Yiyin, CHEN Jiaxian, ZHU Jian, DENG Xiaojun, GUO Dehua

(Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China)

A method was developed for the simultaneous determination of six strobilurin fungicide (E-metominostrobin, azoxystrobin, kresoxim-methyl, picoxystrobin, pyraclostrobin and trifloxystrobin) residues in orange, banana, apple and pineapple samples by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The fragmentation routes of all the compounds were explained by the aid of a fragment predicting software ACD Lab/MS Fragmenter. The samples were extracted by acetonitrile, then cleaned up by amino solid phase extraction cartridges (SupelClean LC-NH2). The extracts were separated on a ACQUITY UPLC BEH C18column (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) with gradient elution. Acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid and 10 mmol/L ammonium acetate containing 0.1% (v/v) formic acid were used as mobile phases. The samples were detected by electrospray ionization (ESI)-MS/MS in positive ion and multiple reaction monitoring (MRM) mode, quantified by external standard method. Good linearities were obtained in the range of 5-100 μg/L (for pyraclostrobin, 1-20 μg/L) with correlation coefficients (r2) greater than 0.999. The recoveries ranged from 60.4% to 120% with the relative standard deviations between 2.15% and 15.1% (n=6). The developed method can meet the inspection of the six strobilurin residues in the orange, banana, apple and pineapple samples.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); solid phase extraction (SPE); fragment predicting software; strobilurin fungicides; fruits

10.3724/SP.J.1123.2017.05009

2017-05-09

.Tel:(021)38620521,E-mail:zhouyao@shciq.gov.cn.

上海市科委科研项目(15142201700).

O658

A

1000-8713(2017)09-0970-10

Foundation item: Shanghai Science and Technology Committee Fund (No. 15142201700).

*