芽孢条式环氧乙烷灭菌生物指示剂孢子计数方法的研究

沈泓　李珏　沈颖　曹炜　吴鑫

摘 要：生物指示剂是一类特定微生物经过特定方法制备的生物制品，它的孢子数量是衡量灭菌工艺生物灭杀力的重要参数。本文通过对不同的稀释剂及前处理方法的研究，改进操作环节来提高回收菌数，以实现对生物指示剂孢子的准确计数。

关键词：环氧乙烷；生物指示剂；孢子计数；芽孢条

中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）16-0202-02

生物指示剂是指一类特定微生物经过特定方法制备的生物制品，这些特定微生物比普通微生物具有更强的耐受性。生物指示剂常用于制药工艺中灭菌设备的性能确认以及气体灭菌法、过滤除菌法的灭菌程序的验证。

孢子数量是衡量灭菌工艺生物灭杀力的重要参数，故需事先确定其适用性，方可应用于产品灭菌工艺的开发和验证。孢子数量同时是基于商品化产品稳定性考察所需要严格控制的内容，生物指示剂使用者在应用前能够对每使用单位的菌落数进行测定。孢子计数普遍存在菌数回收率较低的问题，许多环节都可能影响最终结果，本文通过对不同的稀释剂及前处理方法的研究，改进操作环节来提高回收菌数，以实现对生物指示剂孢子的准确计数。

1 实验材料

1.1 样本收集

经过市场调研发现，目前国内市售芽孢条式环氧乙烷灭菌生物指示剂主要有三家：厂家A，批号BATR-418；厂家B，140918；厂家C，141008。

1.2 仪器设备

MS3涡旋振荡器，IKA；IF450恒温培养箱，Memmert；MLS-3780高压蒸汽灭菌器，Sanyo。

1.3 试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：3303005；供应商：广东环凯）。

吐温-80（批号：20160623；供应商：国药）。

2 实验方法与结果

2.1 以灭菌纯化水作稀释剂，用玻璃珠将样品粉碎

取待测样品1片，放入一支含玻璃珠的内置10ml冷却灭菌纯化水的玻璃试管中，涡旋振荡15min。将试管放入84℃的热水中水浴10min，加热完后迅速以冰水浴冷却。转移1ml的混悬液到试管中，用灭菌纯化水进行适宜的系列稀释，选择孢子数在30～300 cfu/皿稀释级的稀释液进行平皿计数测定。每个平皿中倒入45～50℃的胰酪大豆胨瓊脂培养基，混合均匀，待其凝固，倒扣平皿置36℃进行培养，48h后进行平皿计数，记录各皿的菌落数。每个样本取4片芽孢条式环氧乙烷灭菌生物指示剂平行操作。结果见表1。

2.2 以含0.1%吐温80的灭菌纯化水作稀释剂，用玻璃珠将样品粉碎

将含0.1%吐温80的灭菌纯化水作为稀释剂，其余实验方法同2.1，结果见表2。

2.3 以灭菌纯化水作稀释剂，用匀浆仪将样品粉碎

取待测样品1片，放入一个已灭菌的内置50ml冷却灭菌纯化水的匀浆杯中，9000rpm匀浆5min，其余实验方法同2.1，结果见表3。

2.4 以含0.1%吐温80的灭菌纯化水作稀释剂，用匀浆仪将样品粉碎

取待测样品1片，放入一个已灭菌的内置50ml含0.1%吐温80的灭菌纯化水的匀浆杯中，9000rpm匀浆5min，其余实验方法同2.1，结果见表4。

3 讨论

3.1 不同稀释剂对于活孢子数测定的比较

比较相同粉碎方式不同稀释剂的孢子数测定结果，发现采用含0.1%吐温80的灭菌纯化水作稀释剂比不含吐温的回收率有显著增加，且RSD值明显减小。分析原因，可能是由于吐温80作为表面活性剂能使活菌孢子聚集体分割成细小的微粒，使其分散悬浮在溶液中，起到促使活菌孢子均匀分散的作用。

3.2 不同前处理方法对于活孢子数测定的比较

比较相同稀释剂不同前处理方法的孢子数测定结果，发现采用匀浆法将样品粉碎比采用玻璃珠的回收率有显著增加，且RSD值明显减小。分析原因，可能是由于玻璃珠很难打碎载菌纸片而匀浆仪的综合搅拌刀高速旋转，能将载菌纸片快速、完全地打碎，均匀效果匀浆法更优。

3.3 适宜的活孢子数测定方法

综合3.1和3.2的讨论可见，稀释剂的选择以及前处理的方法对于活孢子数的测定结果的影响是显而易见的。因此，为了真实反映环氧乙烷灭菌生物指示剂活孢子总数，建议选择含适量表面活性剂的稀释剂以及更有利于纸片粉碎、分散的匀浆法进行样品的前处理。endprint