安全剂双苯恶唑酸对水稻精恶唑禾草灵药害的解毒效应

孙润红，徐俊蕾，杨丽荣，张 洁，夏明聪，武 超，薛保国*，吴 坤

(1.河南省农业科学院 植物保护研究所/河南省农作物病虫害防治重点实验室/农业部华北南部农作物有害生物综合治理重点实验室/河南省作物保护国际联合实验室，河南 郑州 450002； 2.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002)

安全剂双苯恶唑酸对水稻精恶唑禾草灵药害的解毒效应

孙润红1，徐俊蕾1，杨丽荣1，张 洁1，夏明聪1，武 超1，薛保国1*，吴 坤2*

(1.河南省农业科学院 植物保护研究所/河南省农作物病虫害防治重点实验室/农业部华北南部农作物有害生物综合治理重点实验室/河南省作物保护国际联合实验室，河南 郑州 450002； 2.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002)

为了解安全剂双苯恶唑酸缓解除草剂精恶唑禾草灵对水稻药害的效果，通过温室水培和盆栽法研究双苯恶唑酸对水稻精恶唑禾草灵药害的解毒效果，并对其解毒机制进行初步探讨。结果表明：水稻萌发期，粳稻和籼稻在0.25、0.5、1 μg/mL精恶唑禾草灵处理下，解毒效果最好的安全剂添加比例分别为1∶1、1∶5、1∶5，粳稻株高、胚根长的抑制率比精恶唑禾草灵单独使用分别降低18.07、37.50，26.56、34.94，41.30、37.50个百分点，籼稻株高、胚根长的抑制率分别降低23.31、42.33，27.22、34.91，46.76、31.14个百分点；水稻两至三叶期，粳稻和籼稻在25、100 μg/mL精恶唑禾草灵处理下，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)活性最高的安全剂添加比例均为1∶1，此时粳稻的GST活性和ACCase活性比精恶唑禾草灵单独使用分别增加42.21%和65.63%、46.72%和140.43%，籼稻的GST活性和ACCase活性比精恶唑禾草灵单独使用分别增加52.18%和105.71%、55.55%和169.52%。安全剂双苯恶唑酸提高了精恶唑禾草灵处理后水稻幼苗中GST、ACCase活性，减轻了精恶唑禾草灵对水稻的伤害，为水稻生产中通过添加双苯恶唑酸降低精恶唑禾草灵对水稻的药害提供了依据。

双苯恶唑酸； 精恶唑禾草灵； 粳稻； 籼稻； 解毒作用； 谷胱甘肽-S-转移酶； 乙酰辅酶A羧化酶

水稻是我国的主要粮食作物，在国家粮食安全中有着举足轻重的地位。由于水稻生长在高温多雨的夏季，杂草发生严重，化学除草是目前水稻种植过程中必不可少的管理措施。然而，长期使用除草剂之后，部分杂草抗药性越来越强，千金子、稗草等抗性杂草的发生越来越严重，成为水稻田恶性杂草，十分难以防治[1-3]。为了解决生产上稻田稗草抗药性和千金子等禾本科杂草防除问题，一些农药生产厂家将旱地防治禾本科杂草的除草剂精恶唑禾草灵用于水稻田。

精恶唑禾草灵属环氧基苯氧基丙酸酯类除草剂，主要抑制脂肪酸合成的关键酶乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)，对稗草、马唐、狗尾草、乡麦娘、硬草、野燕麦等禾本科杂草有很好的药效，在大豆等双子叶作物生产中广泛使用，其对禾本科作物不安全，但加入安全剂后也可以用于小麦田防除禾本科杂草[4-5]。有报道表明，在日本、印度、马来西亚和中美洲，精恶唑禾草灵已用于水稻田除草[6-9]，我国也有将精恶唑禾草灵用于水稻田的报道[10-11]，但也有一些报道表明，精恶唑禾草灵对水稻的药害严重，能引起水稻黄化、生长抑制，甚至死亡[12-13]。

安全剂又称解毒剂或保护剂，可以在不影响除草剂对靶标杂草活性的前提下有选择地保护作物免受除草剂的药害，提高对作物的安全性，在化学除草应用中日益发挥着重要作用[14]。双苯恶唑酸，即S-4-(苯氧基丁基)-N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯，是由安万特公司研究开发的异唑类安全剂，不仅可以提高作物的耐药性，也可以用来解决难除杂草的防除问题，主要用于防除玉米田间1年及常年生杂草等[15]。为了解双苯恶唑酸能否同样减轻精恶唑禾草灵对水稻的伤害，采用温室水培和盆栽法研究了双苯恶唑酸对精恶唑禾草灵的解毒效果，初步探讨了双苯恶唑酸保护水稻免受精恶唑禾草灵药害的作用机制，为水稻生产中通过添加安全剂双苯恶唑酸降低除草剂精恶唑禾草灵对水稻的药害提供依据。

1 材料和方法

1.1供试材料

供试粳稻(郑稻18)由河南省农业科学院粮食作物研究所水稻室提供；供试籼稻(籼稻9113)由信阳市农业科学研究所提供。

1.2试剂和仪器

试剂：95%精恶唑禾草灵原药(杭州宇龙化工有限公司)、双苯恶唑酸(Sigma公司)、丙酮(天津天力化学试剂公司)、0.1% 吐温80(国药集团化学试剂有限公司)、二甲基亚砜(青岛生工生物科技有限公司)。

仪器：紫外分光光度计(上海精科仪器有限公司)、低温离心机(赛默飞世尔科技有限公司)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)、ACCase试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)。

1.3试验方法

1.3.1 水稻萌发期双苯恶唑酸对精恶唑禾草灵的解毒效果试验 将水稻种子放入烧杯中，加入自来水至完全淹没种子，置于室温中浸泡过夜，之后将水稻种子置于铺有双层湿润滤纸的培养皿中，室温培养，待水稻发芽，挑选芽长一致的种子备用。取100 mL烧杯，加入250 g石英砂和60 mL不同质量浓度梯度的药液(精恶唑禾草灵的质量浓度分别为0.25、0.5、1 μg/mL，双苯恶唑酸的添加比例分别为1∶0、1∶0.04、1∶0.2、1∶1、1∶5、1∶25)，以清水为对照(CK)，接入发芽的水稻种子，用保鲜膜封口，置于室温培养3 d后，调查粳稻和籼稻的胚根长，培养6 d后，调查粳稻和籼稻的株高，分别计算抑制率。每个处理设3次重复，数据采用 DPS 7.0软件进行处理和方差分析。

1.3.2 水稻幼苗期双苯恶唑酸对GST和ACCase活性的影响试验 室内盆栽培养粳稻和籼稻幼苗，待水稻生长到两至三叶时，喷施不同质量浓度梯度的药液(精恶唑禾草灵的质量浓度分别为25、100 μg/mL，双苯恶唑酸的添加比例分别为1∶0、1∶0.2、1∶1、1∶5)，以清水为对照(CK)，每个处理设3次重复。施药5 d后，取各处理的水稻叶片0.1 g，分别按照GST试剂盒和ACCase试剂盒说明书进行操作，于340、660 nm测定吸光度，计算GST、ACCase的活性。

2 结果与分析

2.1双苯恶唑酸对萌发期水稻生长的影响

由表1、表2可以看出，随着精恶唑禾草灵质量浓度的增大，其对粳稻和籼稻株高及胚根长的抑制率逐渐增大。0.25、0.5、1 μg/mL精恶唑禾草灵处理对粳稻株高的抑制率分别为31.69%、45.76%、62.28%，对粳稻胚根长的抑制率分别为65.63%、72.44%、83.24%；对籼稻株高的抑制率分别为38.65%、47.52%、69.17%，对籼稻胚根长的抑制率分别为69.69%、74.53%、80.31%。

注：Iso为双苯恶唑酸，Fen为精恶唑禾草灵；同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

精恶唑禾草灵质量浓度相同时，添加不同比例双苯恶唑酸各处理之间对精恶唑禾草灵的解毒效果存在差异。当精恶唑禾草灵质量浓度为0.25 μg/mL时，双苯恶唑酸添加比例为1∶1对其解毒效果最好，对粳稻株高、胚根长的抑制率分别为13.62%、28.13%，分别比0.25 μg/mL精恶唑禾草灵处理降低18.07、37.50个百分点；对籼稻株高、胚根长的抑制率分别为15.34%、27.36%，分别比0.25 μg/mL精恶唑禾草灵处理降低23.31、42.33个百分点。当精恶唑禾草灵质量浓度为0.5 μg/mL时，双苯恶唑酸添加比例为1∶5对其解毒效果最好，对粳稻株高、胚根长的抑制率分别为19.20%、37.50%，分别比0.5 μg/mL精恶唑禾草灵处理降低26.56、34.94个百分点，对籼稻株高、胚根长的抑制率分别为20.30%、39.62%，分别比0.5 μg/mL精恶唑禾草灵处理降低27.22、34.91个百分点。当精恶唑禾草灵质量浓度为1 μg/mL时，双苯恶唑酸添加比例为1∶5对其解毒效果最好，对粳稻株高、胚根长的抑制率分别为20.98%、45.74%，分别比1 μg/mL精恶唑禾草灵处理降低41.30、37.50个百分点，对籼稻株高、胚根长的抑制率分别为22.41%、49.17%，分别比1 μg/mL精恶唑禾草灵处理降低46.76、31.14个百分点。

综合而言，添加不同比例双苯恶唑酸后，降低了精恶唑禾草灵对水稻生长的抑制作用，减轻了精恶唑禾草灵对水稻的伤害。

表2 精恶唑禾草灵处理中添加不同比例双苯恶唑酸对萌发期籼稻生长的影响

2.2双苯恶唑酸对水稻幼苗体内GST活性的影响

从图1可以看出，当精恶唑禾草灵的质量浓度为25、100 μg/mL时，粳稻体内GST活性分别为3.272、3.016 μmol/(min·mg)，分别比对照[4.752 μmol/(min·mg)]降低 31.14%、36.53%；籼稻体内GST活性分别为3.927、3.685 μmol/(min·mg)，分别比对照[6.124 μmol/(min·mg)]降低35.88%、39.83%。

Fen、Iso后的数字表示处理所用药剂的质量浓度(μg/mL)，下同图1 精恶唑禾草灵处理中添加不同比例双苯恶唑酸对水稻幼苗体内GST活性的影响

添加不同比例双苯恶唑酸后，水稻体内GST活性均有所增加。精恶唑禾草灵质量浓度为25 μg/mL条件下，双苯恶唑酸添加比例为1∶0.2、1∶1、1∶5时，粳稻体内GST活性分别为3.948、4.653、4.592 μmol/(min·mg)，分别比精恶唑禾草灵单独使用增加20.67%、42.21%、40.34%；籼稻体内GST活性分别为4.774、5.976、5.743 μmol/(min·mg)，分别比精恶唑禾草灵单独使用增加21.57%、52.18%、46.24%。精恶唑禾草灵质量浓度为100 μg/mL条件下，双苯恶唑酸添加比例为1∶0.2、1∶1、1∶5时，粳稻体内GST活性分别为3.742、4.425、4.368 μmol/(min·mg)，分别比精恶唑禾草灵单独使用增加24.07%、46.72%、44.83%；籼稻体内GST活性分别为4.515、5.732、5.537 μmol/(min·mg)，分别比精恶唑禾草灵单独使用增加22.52%、55.55%、50.26%。

随着精恶唑禾草灵处理质量浓度的增大，粳稻和籼稻GST活性呈降低的趋势，而添加不同比例的双苯恶唑酸，使得GST活性增加，催化谷胱甘肽与精恶唑禾草灵发生轭合，从而减轻了精恶唑禾草灵对水稻生长的影响。精恶唑禾草灵不同质量浓度处理下，添加双苯恶唑酸的比例为1∶1时，GST活性最高。相比较而言，添加不同比例的双苯恶唑酸药液喷施5 d后，籼稻内GST的活性变化总体上较粳稻剧烈，表明添加双苯恶唑酸后，籼稻对双苯恶唑酸产生了更强烈的应激反应。

2.3双苯恶唑酸对水稻幼苗体内ACCase活性的影响

从图2可以看出，当精恶唑禾草灵的质量浓度为25、100 μg/mL时，粳稻体内ACCase活性分别为0.678、0.465 μmol/(min·mg)，分别比对照[1.230 μmol/(min·mg)]降低 44.88%、62.20%；籼稻体内ACCase活性分别为0.542、0.374 μmol/(min·mg)，分别比对照[1.215 μmol/(min·mg)]降低55.39%、69.22%。

图2 精恶唑禾草灵处理中添加不同比例双苯恶唑酸对水稻幼苗体内ACCase活性的影响

添加不同比例双苯恶唑酸后，水稻体内ACCase活性均有所增加。精恶唑禾草灵质量浓度为25 μg/mL条件下，双苯恶唑酸添加比例为1∶0.2、1∶1、1∶5时，粳稻体内ACCase活性分别为0.874、1.123、1.116 μmol/(min·mg)，分别比精恶唑禾草灵单独使用增加28.91%、65.63%、64.60%；籼稻体内ACCase活性分别为0.782、1.115、1.004 μmol/(min·mg)，分别比精恶唑禾草灵单独使用增加44.28%、105.71%、85.24%。精恶唑禾草灵质量浓度为100 μg/mL条件下，双苯恶唑酸添加比例为1∶0.2、1∶1、1∶5时，粳稻体内ACCase活性分别为0.752、1.118、1.107 μmol/(min·mg)，分别比精恶唑禾草灵单独使用增加61.72%、140.43%、138.06%；籼稻体内ACCase活性分别为0.523、1.008、0.999 μmol/(min·mg)，分别比精恶唑禾草灵单独使用增加39.84%、169.52%、167.11%。

施用不同质量浓度的精恶唑禾草灵后，水稻体内ACCase活性均大幅度下降，且随着精恶唑禾草灵处理质量浓度的升高呈降低的趋势。添加不同比例的双苯恶唑酸，使得ACCase活性增加，减轻了精恶唑禾草灵对水稻生长的影响。精恶唑禾草灵不同质量浓度处理下，添加双苯恶唑酸的比例为1∶1时，ACCase活性最高。

3 结论与讨论

本研究结果表明，添加不同比例的双苯恶唑酸，降低了精恶唑禾草灵对水稻生长的抑制作用，减轻了精恶唑禾草灵对水稻的伤害。在水稻萌发期，0.25 μg/mL精恶唑禾草灵处理下，双苯恶唑酸添加比例为1∶1对其解毒效果最好，粳稻株高、胚根长的抑制率比精恶唑禾草灵单独使用分别降低18.07、37.50个百分点，籼稻株高、胚根长的抑制率分别降低23.31、42.33个百分点；0.5 μg/mL精恶唑禾草灵处理下，双苯恶唑酸添加比例为1∶5对其解毒效果最好，粳稻株高、胚根长的抑制率比精恶唑禾草灵单独使用分别降低26.56、34.94个百分点，籼稻株高、胚根长的抑制率分别降低27.22、34.91个百分点；1 μg/mL精恶唑禾草灵处理下，双苯恶唑酸添加比例为1∶5对其解毒效果最好，粳稻株高、胚根长的抑制率比精恶唑禾草灵单独使用分别降低41.30、37.50个百分点，籼稻株高、胚根长的抑制率分别降低46.76、31.14个百分点。因此，在水稻生产中应合理安排精恶唑禾草灵与安全剂双苯恶唑酸的比例。

安全剂的作用机制在过去几十年来一直受到人们的广泛关注，但作用机制仍未阐明。结构活性论(QSAR)、细胞色素P450单氧化酶催化的羟基化理论以及谷胱甘肽轭合论是最为普遍的机制解释[16-18]。其中，谷胱甘肽轭合论指出，安全剂主要通过增加GSH含量及提高GST活性来轭合除草剂的有毒代谢物，从而减轻或消除其毒害[14]。精恶唑禾草灵的作用靶标是脂肪酸合成的关键酶ACCase，因此，ACCase活性的变化也可以作为衡量安全剂对精恶唑禾草灵解毒作用的重要指标。本研究中，在水稻两至三叶期，25、100 μg/mL精恶唑禾草灵处理下，添加不同比例双苯恶唑酸后，粳稻和籼稻体内GST和ACCase活性均有所增加，GST和ACCase活性最高的双苯恶唑酸添加比例均为1∶1。该添加比例下，25 μg/mL精恶唑禾草灵处理时，粳稻和籼稻GST活性比精恶唑禾草灵单独使用分别增加42.21%、52.18%，ACCase活性比精恶唑禾草灵单独使用分别增加65.63%、105.71%；100 μg/mL精恶唑禾草灵处理时，粳稻和籼稻GST活性比精恶唑禾草灵单独使用分别增加46.72%、55.55%，ACCase活性比精恶唑禾草灵单独使用分别增加140.43%、169.52%。

安全剂作为一种增强除草剂除草效果又保护农作物免受除草剂药害的化合物，具有广阔的发展前景及开发应用市场。由于安全剂的作用机制还不十分清楚，因此，从分子水平上研究安全剂的作用机制，结合生理生化学研究除草剂和安全剂对作物的影响迫在眉睫。

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Detoxification Effect of Safener Isoxadifen-ethyl in Protecting Rice from the Phytotoxicity of Fenoxaprop-P-ethyl

SUN Runhong1,XU Junlei1,YANG Lirong1,ZHANG Jie1,XIA Mingcong1,WU Chao1,XUE Baoguo1*,WU Kun2*

(1.Institute of Plant Protection,Henan Academy of Agricultural Sciences/Henan Key Laboratory of Crop Pest Control/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southern Region of North China,Ministry of Agriculture/International Joint Research Laboratory for Crop Protection of Henan,Zhengzhou 450002,China;2.College of Life Sciences,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

The detoxification effect of isoxadifen-ethyl safener on fenoxaprop-P-ethyl was studied by hydroponics-culture and pot-culture in the greenhouse,in order to know whether isoxadifen-ethyl safener could alleviate the injury of fenoxaprop-P-ethyl on rice,and the detoxification mechanism was preliminarily analyzed.In rice germination,the best addition ratios of isoxadifen-ethyl for detoxification in japonica and indica rice under 0.25,0.5,1 μg/mL fenoxaprop-P-ethyl were 1∶1,1∶5,1∶5 respectively,the inhibition rates of plant height and radicle length were reduced by 18.07 and 37.50,26.56 and 34.94,41.30 and 37.50 percentage points compared to the fenoxaprop-P-ethyl alone treatment for japonica rice respectively,and were reduced by 23.31 and 42.33,27.22 and 34.91,46.76 and 31.14 percentage points for indica rice respectively.And in the 2—3 leaf stage,the best addition ratios of isoxadifen-ethyl in japonica and indica rice for the highest GST activity and ACCase activity under 25,100 μg/mL fenoxaprop-P-ethyl were both 1∶1,the GST and ACCase activities of japonica rice were increased by 42.21% and 65.63%,46.72% and 140.43% compared with the fenoxaprop-P-ethyl alone treatment,and the GST and ACCase activities of indica rice were increased by 52.18% and 105.71%,55.55% and 169.52% compared with the fenoxaprop-P-ethyl alone treatement.Therefore，isoxadifen-ethyl safener could increase GST and ACCase activities of rice treated by fenoxaprop-P-ethyl，and alleviate the injury of fenoxaprop-P-ethyl on rice as a whole,which provides the basis in rice production that adding isoxadifen-ethyl safener can reduce the damage of fenoxaprop-P-ethyl to rice.

isoxadifen-ethyl； fenoxaprop-P-ethyl； japonica rice； indica rice； detoxification effect； GST； ACCase

2017-03-03

河南省农业科学院科研发展专项资金项目(201513117)；河南省博士后基金科研资助项目(2015107)

孙润红(1976-)，女，河南孟津人，助理研究员，博士，主要从事植物病害综合防治研究。 E-mail：sunrunhong_2007@163.com

*通讯作者：薛保国(1957-)，男，河南汝南人，研究员，博士，主要从事分子微生物学研究。E-mail：13613714411@163.com 吴 坤( 1963-)，男，河南平舆人，教授，主要从事微生物研究。E-mail：wukun63@126.com

S511；S451.2

： A

： 1004-3268(2017)09-0067-06