微卫星DNA分析国内24个近交系小鼠遗传状况

李银银，吴绍亮，王 洪，萧晓琴，张双悦，郭 萌，李长龙，吕建祎， 刘 欣，陈振文，杜小燕*

研究报告

微卫星DNA分析国内24个近交系小鼠遗传状况

李银银1，吴绍亮2，王 洪3，萧晓琴4，张双悦4，郭 萌1，李长龙4，吕建祎4， 刘 欣4，陈振文4，杜小燕1*

近交系小鼠具有遗传均一性的特点，以及对各种反应的一致性、可再现性、敏感性等均比较好的特点，广泛应用于医学生物学各项研究中。其遗传的同源性、稳定性和可辨性使不同地区的研究结果具有更高的可比性。对近交系小鼠的遗传质量控制，直接影响着动物实验结果的准确性、可重复性和科学性[1]。而遗传检测是保证实验动物遗传质量的重要措施。对近交系的遗传监测检测主要是通过测定其基因的纯合性和表型品系内的一致性，证实该品系是否保持原来的遗传特性，是否发生基因突变或基因污染[2]。目前我国实验动物遗传检测国标中主要对生化位点检测近交系遗传状况的方法有较为详细的规定，对分子生物学的方法如微卫星DNA标记(microsatellite marker)等方法没有推荐的位点和操作标准。微卫星一般由1～6 bp核苷酸的串联重复片段构成，重复10～60次左右，广泛存在于真核细胞基因组中。平均每10 kb就出现一个STR(short tandem repeat)[3]。微卫星因数量多、分布广、多态性丰富、呈共显性遗传方式以及检测快速方便等优点而备受推崇[4]，已作为衡量人类和动物基因组整体稳定性的良好指标，且在近交系小鼠遗传监测中得到广泛应用。国内关于利用微卫星方法检测近交系小鼠的报道也有很多，涉及到的品系包括BALB/c、C57BL6、TA1、TA2、T739、SCID、M615、C3H和DBA等，选取的微卫星位点也从几个至几十个不等[5-8]。为了进一步开展近交系小鼠遗传检测的标准化研究，本试验选取分布于小鼠20条染色体上的30个微卫星位点对国内包括常用品系和基因修饰品系共24个近交系小鼠品系进行遗传检测，以期对近交系小鼠微卫星检测技术进行较系统的研究，为该方法在近交系小鼠遗传质量检测中的广泛应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

选取国内较常用的近交系小鼠品系和部分基因修饰小鼠品系共24个近交系小鼠品系，分别来自北京(4家单位)、天津、上海、广州4个地区，均为清洁级或SPF级。样品来源、编号、品系名称、性别及动物数目等信息见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠基因组DNA的制备

取上述24个小鼠品系动物的肝脏组织或者鼠尾0.1 g，加入DNA裂解抽提缓冲液2 mL，加入20 mg/mL蛋白酶K 20 μL，RNA酶10 μL，45℃～55℃消化过夜，酚-氯仿法提取组织DNA，沉淀后，加入TE缓冲液进行溶解。经Nanodrop 2000 C微量分光光度计检测吸光度A260/A280比值在1.8～2.0之间，检测样品合格。取DNA原液适量稀释成50～100 ng/μL作为DNA模版，于4℃保存备用。

1.2.2 微卫星位点的选择与引物的合成

本研究所用30个微卫星位点从相关文献中选取[9]，位点的选择尽量均匀分布于小鼠的1～20号染色体上，且具有较高的多态性。荧光引物委托上海生工有限公司合成。位点PCR条件前期已经过优化。其中30个位点名称、引物标记荧光名称、等位基因数及等位基因范围如表2中所示。

1.2.3 PCR扩增

PCR反应体系：总反应体系20 μL，其中：10×PCR buffer 2 μL，dNTP Mg2+plus(100 μmol/L)1.2 μL，上下游引物(100 μmol/μL)各0.1 μL，Taq 酶(5 U/μL) 0.1 μL，50～100 ng/μL基因组DNA 1 μL，双蒸水(ddH2O)15.5 μL。

PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s；不同位点54℃～64℃不同温度退火30 s；72℃延伸30 s；35个循环；72℃继续延伸 8 min；扩增产物于4℃保存。[9]

1.2.4 PCR产物STR扫描

扩增产物应用STR扫描仪进行扫描，一次扫描可以同时扫描三个微卫星位点，三个位点分别用三种荧光 FAM、HEX、TAMRA进行标记[10]，这三个位点对同一个小鼠样品的PCR扩增产物按照1∶3∶5 体积比混合后取1 μL上样，进行STR扫描。

扫描结果由GeneMarker V2.2.0软件判读141个样本在30个微卫星位点的扩增片断大小。每个位点的等位基因根据扩增片断大小从大到小顺序排列记录为A、B、C、D等，每个样本的基因型即可记录为AA、BC、AC等形式。[9]

表1 24个小鼠近交品系样品来源、编号、品系名称、性别、数目

表2 30个微卫星位点名称、引物标记的荧光名称、在24个近交系中检测到的等位基因数及等位基因范围

2 结果

2.1 STR扫描结果

PCR产物在STR扫描仪上扫描，不同荧光标记显示不同颜色的扫描图形。FAM荧光标记的显示出蓝色峰形，HEX荧光标记的显示出绿色峰形，TAMRA标记的显示出黑色峰形。同一个DNA样品用三个不同位点扩增的PCR产物即可同时检测，在30 bp左右大小间隔。显示如图1。在24个近交品系中基因分型得到的等位基因数和等位基因片段大小见表2。在品系间30个位点都呈现了多态性，位于小鼠17号染色体上的D17Nds3位点具有10个等位基因，D6Mit102、D13Mit3、D5Mit48三个位点分别具有9、8、8个等位基因，同样具有较高的多态性。等位基因数目最少的是D9Mit21、D4Mit23、D14Mit3等3个位点，只有2个等位基因型。

注：(A)D4Mit235位点的TAMRA标记的峰形 图;(B)D2Mit15位点的HEX标记的峰形 图;(C)D9Mit23位点的FAM标记的峰形图。图1 三个不同位点不同荧光标记PCR产物同 时检测的峰形图Note.(A)TAMRA of D4Mit235；(B)HEX of D2Mit15；(C)FAM of D9Mit23.Fig.1 The peak forms of PCR products in a 3-plex fluorescent-PCR of 3 loci

2.2 各品系小鼠微卫星检测结果

30个微卫星位点引物对141只近交系小鼠样本的PCR扩增产物，经STR扫描后都出现了典型的波形。通过判读STR扫描结果，对不同样品进行等位基因分型。其等位基因分型结果如表3中所示。从表中可以看出，在24个近交品系中，有16个品系17个群体(分别是NCPC/2、db/db、615、NOD/LtJ、CBA/J、DBA/1(北京4)、129(北京3)、129(北京4)、TA1、MRL/LPR、C3H/HeJ、BALB/c、SCID、DBA/2、SCID-BG、A2A-2-B6和EGFP-B6品系，占总检测品系数的66.7%)在30个位点上均表现为纯合基因型，在6只样品间呈单态性。而其余品系的9个群体(分别是 SAMP8、DBA/1(北京3)、TA2、NOD-SCID、BALB/c-NU、C57BL/6J、FVB、EYFP-B6和C系-FVB)，在个别位点上出现了杂合基因型，或/且在6只样品间呈多态性，例如BALB/c-NU在D13Mit3位点上有2只动物基因型为杂合的BC型，而且在6只动物间是多态性的。

表3 24个品系30个微卫星位点等位基因STR扫描结果

动物内出现多态的品系数目Numbersofpolymorphicstrains2020203522品系StrainsD5Mit48D17Nds3D19Mit3D16Mit9D7Mit12D18Mit19D8Mit14D15Mit15D17Mit11D18Mit9位点多态数目NumbersofpolymorphiclociNCPC/2EEFFBBBBBBBBCCCCBBDD0db/dbCCGGDDDDCCDDBBAAFFAA0615CCAADDBBEEDDAAAABBBB0NOD/LtJCCJJDDDDDDBBBBDDDDDD0CBA/JBBCCDDDDBBBBBBAABBDD0SAMP8CCDDCCBBCCEEBBDDBBAA2DBA/1⁃北京3CC(DD)JJ(EE)DDDDCC(AA)BB(DD)BBDDDD(FF)DD19DBA/1⁃北京4CCJJDDDDCCBBBBDDDDDD0129⁃北京3GGEEBBDDEEEEAAAACCCC0129⁃北京4GGEEBBDDEEEEAAAACCCC0TA1DDFFAADDEEDDCCEEFFAA0TA2DD(CC)EE(JJ)DDDDAA(CC)DD(BB)BBDDFF(DD)DD19NOD⁃SCIDHHFFDDDDEEDDCCDDAADD1MRL/LPRAAAADDDDBBEECCDDBBDD0C3H/HeJCCBBDDCCEEAACCAABBDD0BALB/c⁃NUDDHHDDDDEEAC(AA+CC)AAAAEEDD2BALB/cEEHHDDDDEECCAAAAFFDD0SCIDFFIIDDDDEEAAAAAAFFDD0C57BL/6JCCEEDDAAEEDDBBAABBAA1DBA/2CCHHDDDDCCAABBDDFFDD0SCID⁃BGDDIIDDDDEEAAAAAAFFDD0FVBDDJJDDDDEEBBCCDDAAAA1A2A⁃2⁃B6CCEEDDAAEEDDBBBBBBAA0EGFP⁃B6BBEEDDAAEEDDBBAABBAA0EYFP⁃B6CCEEDDAAEEDDBBAABBAA1C系⁃FVBDDJJDDDDEEBBCCEEAAAA1动物内出现多态的品系数目Numbersofpolymorphicstrains2200230020

注：AA(CC)表示多态位点，括号内为多态等位基因型；基因型前面的数字表示多态样品数目，没有数字表示只有一个多态样品。

Note. AA(CC) means the polymorphic loci and the letters between the brackets represent the polymorphic alleles. The number before allele represents the times that polymorphic loci occurs. No number after allele means only one sample is polymorphic.

3 讨论

目前使用微卫星位点对小鼠遗传检测的研究较多，张树辉等[11]用42个位点对9种近交系小鼠DNA的多态性进行了研究，谢建云等[12]用24个位点检测14个品系近交系小鼠，王洪等[5]用20个位点检测11种近交系小鼠，结果都证实了分子遗传标记比生物化学法更准确、可靠，可用于常规检测近交系小鼠遗传质量[13]。与已有研究相比，本实验所选的微卫星位点数和检测的近交系品系数量均比较多，而且本研究用的30个微卫星位点，分布在小鼠的1～20号染色体上，在本实验中对近交系小鼠进行检测的结果说明，能够较好的反映近交系小鼠的遗传特性。在这30个微卫星基因位点上，共检测到135条条带，即135个等位基因型，比用封闭群检测得到的等位基因型数量少[9]，但是等位基因片段的范围有所扩大，如在D6Mit102位点由131～177扩大到123～173片段大小。

从理论上讲，品系间多态性越好的位点越适合进行品系鉴定，从表3的结果也可以看出，用这30个位点可以对24个品系进行区分，如用D6Mit102位点就可以将FVB、TA1、NOD/LtJ、C57BL/6J、MRL/LPR、SAMP8、BALB/c、NOD-SCID、C3H/HeJ等9种品系从分子水平进行鉴定，因为这些品系在该位点具有特有的基因型。用具有10个等位基因型的D17Nds3位点也可以对多个品系进行鉴定。即使对基因修饰动物与背景动物也可以用这微卫星进行鉴别，例如以3个基因修饰近交品系A2A-2-B6、EGFP-B6、EYFP-B6在D13Mit3和D6Mit8这两个位点的基因型和背景品系C57BL/6J不同，由此将它们和背景动物区分开来。

从位点特性分析的结果显示，有一些位点是容易发生突变或呈现多态性的，有20个位点在至少1个品系的动物间出现了多态性，最高的为D7Mit281位点，在5个品系动物间均出现了多态性的特征，分别是FVB、C系-FVB、TA2、DBA/1(北京3)、C57BL/6J。其次是D6Mit102和D13Mit3位点分别在4个品系的动物间出现了多态性的特征，D6Mit9和D18Mit19两个位点分别在3个品系的动物间出现了多态性的特征，这些位点在用微卫星进行近交系遗传质量检测时要引起注意和适当选择。

本研究所用30个微卫星位点是本团队进行封闭群小鼠群体遗传分析时筛选到的位点[9]，从表3中可以看出，在24个所检测的品系(来源于26个群体)中，大多数品系内的6只动物间都保持了单一基因型的特征，但是有几个品系在品系内有两个基因型，出现同一品系内部存在多态性的结果，表明该品系在保种育种过程中可能出现基因污染，或传代过程中可能发生变异。如TA2和DBA/1(北京3)在多个位点上是多态的，且这两个品系中都是同一只动物出现多态的等位基因型，表明这品系内的这只动物可能发生了遗传突变或基因污染。因此，在筛选微卫星位点进行小鼠遗传检测时，要综合考虑近交系动物本身的特征来进行选择。在以B6为背景的突变系中，A2A-2-B6品系在D10Mit12、D15Mit15两个位点与背景不同，EGFP-B6品系在D10Mit12、D13Mit3、D5Mit48这3个位点与背景不同，而EYFP-B6品系在D10Mit12位点与背景不同，在D13Mit3位点出现6个样品中有一个与背景不同。表明这些突变系可能与背景存在微卫星多态性差异。在以FVB为背景的突变系小鼠中，C系-FVB品系在D7Mit281和D15Mit15两个位点中也出现多态性。这些位点既可以参考作为基因修饰动物与背景动物的鉴别，也说明这几个位点可能在制备基因修饰动物的过程中可能发生变异的概率较大，不易维持原有等位基因。而在不同单位来源的同一品系可能由于亚系出现而产生差异，如来自北京3和北京4两个单位的DBA/1出现多态性，可能就是长期分开繁殖而产生了差异。

综上所述，本研究所选取的30个位点可参考用于国内常用和基因修饰近交系小鼠的遗传检测，对其遗传质量进行适当的评价，也可针对多个品系进行品系检测鉴定。

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(1.首都医科大学基础医学院实验动物学系,北京 100069； 2.山东省临沭县人民医院,山东 临沂 276700； 3.中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050； 4.首都医科大学基础医学院遗传学系,北京 100069)

目的 利用微卫星位点对国内24种近交系小鼠进行遗传状况分析。方法 用前期筛选的富含多态性和等位基因数多的30个小鼠微卫星位点，合成荧光标记引物，对近交系小鼠基因组DNA进行PCR的扩增，经STR扫描对各近交系小鼠品系进行基因分型。结果 在24个近交系小鼠品系中，有16个品系在品系内在30个位点上均具有相同基因型。而在不同品系间同一位点具有多态性，可初步对不同品系进行鉴别区分。其余品系内个别动物存在多态性。结论 所选位点可以参考用于近交系小鼠遗传质量检测分析，并进行初步品系检测鉴定。

近交系小鼠；遗传质量分析；微卫星DNA

Genetic quality analysis of 24 domestic inbred mouse strains by microsatellite DNA

LI Yin-yin1， WU Shao-liang2， WANG Hong3， XIAO Xiao-qin4， ZHANG Shuang-yue4， GUO Meng1， LI Chang-long4， LV Jian-yi4， LIU Xin4， CHEN Zhen-wen4， DU Xiao-yan1*
(1.Department of Laboratory Animal, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069,China； 2.People's Hospital of Linshu County, Shangdong Linyi 276700； 3.Institute of Laboratory Animal Resources, National Insitute for Food and Drug Control, Beijing 100050； 4.Department of Genetics, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069)

Objective To analyze the genetic quality of 24 domestic inbred strains mice using microsatellite loci panel. Methods Previously selected 30 microsatellite loci of mouse with high polymorphism and more allele numbers were used to synthesize corresponding fluorescently-labeled primers. Then the genomic DNA samples of each mouse were amplified by PCR and the products were analyzed by STR scanning to genotype the inbred strains of mice. Results Out of the 24 inbred strains, 15 inbred strains showed the same genotype within one strain at 30 loci. Among different strains, microsatellite loci indicated polymorphism which could be used to distinguish different strains. However, the rest 9 strains demonstrated polymorphism within strains. Conclusions Our stuoly provides a useful microsatellite panel to detect genetic quality of inbred mice and distinguish different strains with the optimized microsatellite loci.

Inbred strains; Mice; Genetic quality; Microsatellite DNA

国家科技支撑计划(2015BAI07B01)；国家自然科学基金(31372272，31572341)。

李银银(1989-)，女，硕士研究生，专业：实验动物学。E-mail： yyl7590@163.com

杜小燕(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：实验动物教学和研究。E-mail： duduyan@ccmu.edu.cn

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0043-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.009

2016-11-29