BIM基因多态性对晚期肺腺癌一线EGFR-TKIs疗效影响回顾性研究

钱坤 张毅 支修益

IPASS、OPITIMAL等试验奠定了表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)在有EFGR突变的晚期非小细胞肺癌患者中的一线治疗地位,在EGFR突变的人群中其有效率可达80%以上[1,2],但是仍然有20%左右的EGFR突变患者治疗效果并不理想,表现为原发性耐药或者无进展生存期(progression free survival, PFS)较短,许多研究[3,4]提示可能存在其他信号通路和基因位点影响TKI的疗效.BCL-2蛋白家族是细胞凋亡进程中的重要调节蛋白,BIM基因作为 BCL-2家族成员之一,是参与细胞凋亡的重要介质.研究[5,6]发现东亚人群中BIM基因的2号内含子存在缺失多态性,导致患者会表达缺乏BH3结构域,即没有促凋亡活性的BIM亚型,从而引起该类患者对EGFR-TKIs的原发耐药或削弱TKIs的临床疗效.本研究通过对晚期肺腺癌患者的BIM多态性检测,分析BIM多态性与EGFR-TKIs药物疗效相关性,并探索不同类型标本BIM检测的相关性.

1 材料和方法

1.1 研究对象 本研究入选2013年2月-2014年11月间经宣武医院胸外科诊断明确的IIIb期-IV期肺腺癌患者85例,其中男性30例,女性55例;年龄范围35岁-82岁,中位年龄58岁;临床分期IIIb期34例,IV期51例;有吸烟史29例,无吸烟史56例(表1).所有患者均于接受TKI药物之前通过穿刺或者手术的方式取得病理组织.入选标准:①肿瘤-淋巴结-转移(tumor-node-metastasis, TNM)分期为IIIb期-IV期的肺腺癌,有EGFR基因19和/或21外显子敏感突变;②患者年龄18岁-80岁;③血液学、生化和器官功能:血红蛋白≥100 g/L;中性粒细胞绝对计数≥2.0 X109/L;血小板计数≥100X109/L;总胆红素≤1.5倍正常值上限;谷丙转氨酶和谷草转氨酶≤2.5倍正常值上限;肌酐≤1.5倍正常值上限;且肌酐清除率≥60 mL/min;④美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)行为状态评分0分-2分,预期寿命大于12周.排除标准:①既往合并恶性肿瘤病史;②已知对吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼中的任何成分过敏;③既往患间质性肺病,基线时计算机断层扫描(computed tomography, CT)扫描发现存在特发性肺纤维化;④任何不稳定的内科系统性疾病和感染性疾病;④已知的人类免疫缺陷病毒感染;⑤混有小细胞肺癌成份的患者;⑥怀孕或哺乳期妇女;

1.2 标本来源组织切片样本 所有样本均为首都医科大学宣武医院收集,病理明确诊断为肺腺癌,采用甲醛固定石蜡包埋(formalin-fixed and parrffin-embedded, FFPE)组织切片样本,5 μm厚切片不少于10片,室温存放.样本中的肿瘤组织至少占整个样本的30%.全血样本:使用EDTA抗凝剂的真空采血管,取不少于4 mL的全血,存放于2oC-8oC、24 h内送检.

1.3 治疗方法 患者根据不同情况治疗给予吉非替尼250 mg 1次/日或者厄洛替尼150 mg 1次/日或者埃克替尼125 mg 3次/日口服,因疾病进展或不能耐受的毒性反应而停止.患者服药后4周进行一次胸部CT平扫,根据实体瘤疗效评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST)标准进行判效,若肿瘤没有进展(progressive disease, PD)可继续服药,此后需每4周一次访视,口服药物8周后进行最终判效.服药期间每8周进行一次胸部CT扫描复查直至疾病进展或发生不能接受的毒性反应停药.

1.4 样本DNA提取 FFPE样本使用德国Qiagen公司的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取FFPE样本基因组DNA,将病理组织从切片中提取,全血样本采用Qiagen公司血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取全血样本基因组DNA,按照使用说明进行操作,石蜡样本和全血样本提取的DNA样品满足OD260/OD280=(1.8±0.2),OD260/OD230≥1.7;浓度为20 ng/μL-50 ng/μL.DNA于-20oC贮存至使用.

1.5 EGFR基因突变检测 采用北京雅康博生物科技有限公司生产的人EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法),实时荧光PCR仪为Stratagene Mx3000P,循环设置为:95oC、10 min;95oC、15 s,60oC、1 min,共40个循环.

1.6 BIM基因多态性检测 采用北京雅康博生物科技有限公司生产的人BIM基因多态性检测RUO试剂盒(荧光PCR法),实时荧光PCR仪为Stratagene Mx3000P,循环设置为:95oC、10 min;95oC、15 s,60oC、1 min,共40个循环.

1.7 统计分析 通过SPSS 16.0进行统计分析,不同BIM结果的患者服药的客观有效率(objective response rate,ORR)间差异采用Fisher's精确检验进行分析;多因素分析采用Cox回归;单因素分析采用Kaplan-Meier分析及Logrank检验.生存曲线采用GraphPad Prism 5 Project软件制作.所有统计分析过程中,双侧检验P<0.05为存在统计学差异.

2 结果

2.1 EGFR基因突变检测和BIM基因多态性结果 自2013年2月-2014年11月,收集EGFR 19、21外显子突变85例.其中19外显子突变35例,21外显子突变50例(图1).根据85例石蜡组织样本BIM基因多态性检测结果显示,BIM基因缺失14例(16.47%),纯和无缺失71例(83.53%).在13例对照样本中,石蜡样本检出BIM基因缺失2例(15.4%);血液样本检出BIM基因缺失2例(15.4%),且为相同患者样本.

2.2 BIM基因多态性与一般临床特征的关系 BIM基因多态性与患者年龄、性别、分期及吸烟史均无统计学差异(P>0.05)(表2).

2.3 BIM基因多态性与短期疗效和无进展生存的关系 82例具备短期疗效数据的患者中,不同BIM多态性的患者在应用药物后的客观有效率无统计学差异(P>0.05)(表3).在上述82例具备短期疗效数据的患者中,有67例患者的随访数据可供PFS分析.随后采用Kaplan-Meier曲线分析BIM基因多态性与该67例患者PFS之间的关系(图2).BIM基因缺失、无缺失患者接受药物治疗的中位PFS分别为7.1个月、12.8个月,且存在统计学差异(P=0.013).

图 1 EGFR突变检测图谱Fig 1 The amplification plots of EGFR mutation. EGFR: epidermal growth factor receptor

2.4 单因素分析PFS结果 从表4可以看出BIM基因多态性、无多态性患者接受药物治疗的中位PFS分别为7.1个月、12.8个月,且存在统计学差异(P=0.013).男性和女性中位PFS分别为10.7个月、12.1个月(P=0.835) ,无统计学差异(P>0.05);吸烟组和非吸烟组,中位PFS分别为9.7个月、12.1个月(P=0.974),无统计学差异(P>0.05); EGFR 19、21外显子中位PFS分别为8.7个月、12.2个月(P=0.303) ,无统计学差异(P>0.05).

3 讨论

本研究85例FFPE样本BIM基因多态性检测结果显示,BIM基因缺失多态性14例(16.47%),Nakagawa等[3]研究报道BIM基因缺失多态性只存在于东方人群中,在EGFR基因突变的NSCLC患者中,BIM基因多态性率占12.9%.人类基因组单倍体图计划中的中国人BIM缺失多态性携带率为20.5%[7].邓伟等[5]报道24.3%(42/169)的患者存在BIM缺失多态性.相比而言,德国等欧洲人群则未见BIM缺失多态性[5].不同文献报道的BIM缺失多态性比例在12.3%-24.3%之间,本试验16.47%的阳性率符合文献报道范围之内.

表 1 患者的般临一床特征Tab 1 General clinical characteristics of the patients

图 2 BIM基因多态性与无进展生存的关系Fig 2 Single factor analysis of the relationship between PFS and BIM gene polymorphism. PFS: progression-free survival.

表 2 BIM基因多态性与一般临床特征相关性分析Tab 2 Relationship between BIM gene polymorphism and general clinical characteristics

表 3 BIM多态性与短期疗效的差异Tab 3 Relationship between BIM gene polymorphism and therapeutic efficacy of tyrosine kinase inhibitor

表 4 单因素与PFS相关性分析结果Tab 4 Results of univariate analysis of PFS

BIM基因广泛分布于机体正常组织细胞,包括破骨细胞、成骨细胞、肥大细胞、上皮细胞、血管内皮细胞和神经细胞等正常组织中,在细胞凋亡中BIM是必不可少的,在恶性肿瘤细胞中亦有表达.在13例对照样本中,石蜡样本与血液样本检出2例结果相同的BIM基因缺失多态性,由于本研究使用的病理标本和全血标本均是患者服用EGFR-TKIs之前的标本,没有受到药物影响,初步证明血液样本检测BIM基因多态性的可行性,但是例数较少,且缺少患者用药后的对比检测,因此血液检测BIM多态性的可行性有待进一步验证.

从表2也可以看出BIM基因多态性在患者年龄、性别、分期及吸烟史等因素中分布均无统计学差异(P>0.05),也说明BIM多态性是广泛分布于人群中的一种随机性分布,不因患者性别等先天因素或者吸烟等后天环境所改变.但是有文献[8]报道某些药物如AZD6244能够增强FOXO3的表达,进一步提高BIM表达和诱导细胞凋亡.

从表3可以看出82例具备短期疗效数据的患者中,BIM多态性组ORR为28.57%,而BIM无多态性组为39.71%,两组统计学上无显著差异.说明对于有EGFR突变的晚期肺腺癌,BIM多态性并不是一线使用TKIs治疗有效性的预测因素.郑蕾等[9]报道,在123例复治晚期非小细胞肺癌患者中,化疗失败后接受吉非替尼或厄洛替尼靶向治疗,其ORR和疾病控制率(disease control rate, DCR)在BIM多态性和无多态性人群中也无统计学意义.

本研究有67例患者的随访数据可供无进展生存分析,通过图2可以看出BIM基因具有缺失多态性、无多态性患者接受药物治疗的中位PFS分别为7.1个月、12.8个月,且存在统计学差异(P=0.013),说明BIM多态性与TKI一线治疗晚期肺腺癌的长期疗效相关.由于BIM基因的2号内含子存在缺失多态性,导致产生没有促凋亡活性的BIM亚型,从而引起该类患者对EGFR-TKIs削弱的临床疗效,但是这一过程为何表现出只是PFS的差异而不是原发性耐药的方面的差异仍不得而知.Costa等[10]研究结果证实,对吉非替尼等TKIs有效的肺癌患者癌细胞内BIM表达数量显著增加,而BIM基因敲除后原来敏感的肿瘤细胞则对TKIs耐药,说明BIM表达水平在TKIs介导的肿瘤细胞凋亡过程中具有十分重要的作用.只有当BIM表达完全消失才会导致迅速耐药,而无论是BIM多态性还是低表达所引起的是一种缓慢性耐药,所引起的最终结果就是这类患者PFS缩短.至于BIM多态性与低表达之间的关系尚需要进一步试验以得出结论.

除了检验BIM基因的多态性与中位PFS的关系外,还将性别、吸烟状况和EGFR突变位点与PFS进行了独立的分析.虽然非吸烟组的PFS明显长于吸烟组,但是仍无统计学差异,性别和EGFR外显子敏感突变一样也不是PFS的独立预测因素,这一结果表明以前认为的"亚洲不吸烟女性腺癌"是EGFR-TKIs治疗优势人群可能是这类人群EGFR突变率较高,而并非是性别和吸烟这些因素决定的长期疗效[1].

通过本回顾性研究可以得出以下结论:①BIM基因缺失多态性作为一种仅存在于东方人种中的突变随机分布,与性别等先天因素和吸烟等后天因素无关,不同文献报道的BIM缺失多态性比例在12.3%-24.3%[5,7,9].②BIM基因多态性的有无对晚期肺腺癌一线EGFR-TKIs治疗患者的PFS有统计学差异,检测患者BIM基因多态性对晚期肺腺癌 EGFR-TKIs治疗患者的评估预后有一定指导意义.但是BIM基因多态性的有无对晚期肺腺癌一线EGFRTKIs治疗的短期疗效无法起到预测作用.③晚期肺腺癌一线EGFR-TKIs治疗患者的PFS与性别、吸烟状况等因素无关,EGFR 19和21突变位点在这类人群进行TKIs治疗中PFS也无统计学差异.④基于BIM多态性在体细胞和肿瘤细胞检测结果相同,虽然例数较少可以初探采用全血检测初治病人的BIM多态性结果,但复治患者的结果有待进一步验证.