不同试验条件对藻蓝蛋白提取效率的影响

张子墨+张发宇+范帆

摘要：以实验室培养的水华蓝藻单种[铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa，M.A）、水华微囊藻（Microcystis flos-aquae，M.F）、惠氏微囊藻（Microcystis wesenbergii，M.W）、魚腥藻（Anabaena sp，A.s）]以及野外新鲜水华蓝藻为研究对象，通过设置不同细胞破碎方法和提取剂种类，筛选并优化藻蓝蛋白荧光分析法的前处理技术。结果表明，冻融试验中，冷冻温度与提取剂添加顺序对蓝藻细胞破碎率无显著影响；以去离子水为提取剂时，冻融2次即可达到最佳破壁条件；在冻干试验中，蓝藻真空抽滤在滤膜上能提高蓝藻细胞的破碎率；综合比较冻融和冻干，后者对蓝藻细胞的破碎效率高于前者；对比3种提取剂对藻蓝蛋白的提取效率，去离子水对藻蓝蛋白的提取效率最高。

关键词：藻蓝蛋白；铜绿微囊藻；反复冻融；冷冻干燥

中图分类号：X835 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）15-2921-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.031

Abstract： The cyanobacteria cultured in the laboratory（Microcystis aeruginosa，Microcystis flos-aquae，Microcystis wesenbergii and Anabaena sp） and fresh blue algae were used as the research object，by intercalating different cell disruption method. The results showed thatin freeze thawing experiments，the freezing temperature and the adding order of the extracting agent had no significant effect on the rate of breaking. Using deionized water as the extraction agent， freezed thawing two times can be used as a selection. In the freeze-drying experiment，cyanobacteria vacuum filtration can improve the crushing rate of the cyanobacteria cells. Comprehensive comparison of freeze thaw and freeze drying， the latter on cyanobacterial cell crushing efficiency was higher than that of the former. Compared with the extraction efficiency of the three extracts， the results showed that the extraction efficiency of the phycocyanin by the water was the highest.

Key words： phycocyanin；Microcystis aeruginosa；repeated freezing and thawing；freeze drying

藻蓝蛋白（Phycocyanin，PC）是一种水溶性的蓝藻辅助色素，具有荧光特性[1]，是水华蓝藻所特有的光合色素，能够用来表征蓝藻的生物量[2]。目前，常用于检测藻蓝蛋白的分光光度法灵敏度不高，当样品中藻蓝蛋白含量为10 μg/L时，难以检出[3]。高效液相色谱法检测限低，灵敏度很高，但前处理过程复杂，成本高[4]。而荧光检测法灵敏度较高，需要的样品量少，相比较而言更经济快捷[5]。Kasinak等[6]和Lee等[7]的研究表明用荧光法测得的藻蓝蛋白浓度与蓝藻生物量之间有很强的相关性。除此之外，关于蓝藻活体荧光或藻蓝蛋白荧光与蓝藻生物量之间定量关系的研究也有较多报道[8-13]。

藻蓝蛋白荧光检测法需要对蓝藻细胞进行预处理，包括藻细胞的破碎和藻蓝蛋白的提取。目前，关于蓝藻的破碎方法有很多，常用的有溶胀法[14]、超声波法[15，16]、机械研磨法[2，17]和反复冻融法[18，19]等，每种方法都各有优缺点。溶胀法操作简单，但提取周期长；超声波法处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波作用过程中会产生大量的热量，需结合冰浴才可进行，否则温度过高会导致藻蓝蛋白变性；机械研磨法破碎细胞效率高，但易造成样品残留。张静等[19]比较不同破碎方法后，认为反复冻融法提取藻蓝蛋白浓度高于其他方法，冻融法提取野外蓝藻的藻蓝蛋白浓度可达3.0 mg/L，而超声波法提取藻蓝蛋白浓度仅为1.0 mg/L，并且冻融法较其他方法操作简单，没有其他化学试剂的干扰。庞晓宇等[16]对比了Asolctin-CHAPS缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液和Tris试剂对藻蓝蛋白的提取效率，得出磷酸盐缓冲液对藻蓝蛋白提取高效、经济、易保存的结论。对于藻蓝蛋白的提取效率研究中多以藻蓝蛋白浓度[20，21]、吸光度比值[15，21，22]以及得率[19]来评价。

目前，鲜有关于利用冻干法来破碎蓝藻细胞，提取藻蓝蛋白的研究。Williams等[23]研究表明，蓝藻细胞在冷冻过程中在细胞内形成冰晶，其体积比原来的增大9%～10%。在细胞内、外形成冰晶的瞬间，挤压细胞膜的薄弱部分并使之破裂，而在真空冷冻干燥机的作用下，细胞内冰晶升华，可完全破坏细胞膜的疏水结构。此方法操作简单，用时较短。因此，本研究以实验室培养的水华蓝藻和巢湖水华蓝藻为研究对象，以单位蓝藻细胞中提取藻蓝蛋白的含量为评价指标，通过设置不同破碎方法和提取剂种类，筛选并优化藻蓝蛋白荧光分析法前处理技术，提高方法的检测灵敏度和操作便捷性。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

试验用藻为巢湖新鲜水华蓝藻和实验室培养的单种：铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa，M.A）、水华微囊藻（Microcystis flos-aquae，M.F）、惠氏微囊藻（Microcystis wesenbergii，M.W）、鱼腥藻（Anabaena sp，A.s），藻种取自中国科学院武汉水生生物研究所藻种库。采用BG11培养基培养，培养温度为25 ℃，光照度为2 000 lx，时间设置为12 h昼/12 h夜。

1.2 蓝藻细胞破碎

取一定量实验室培养的蓝藻藻液，用显微镜计数法测定藻细胞浓度，然后用0.45 μmGF/C膜真空抽滤藻液，把抽滤后的样品置于15 mL离心管中冷冻。样品分为两组，一组在室温避光条件下解冻，另一组在预冷的冷冻真空干燥机（Biosafer-10）中冻干。为研究冻融次数对蓝藻细胞破碎效率的影响，将上述冻融过程分别重复1～7次，每次设3组平行。为研究冻融和冻干对不同种类蓝藻细胞的破碎效果，选用了4种实验室培养的蓝藻样品：铜绿微囊藻、水华微囊藻、惠氏微囊藻和鱼腥藻。为研究冻融和冻干对不同藻细胞浓度样品的破碎效果，将铜绿微囊藻原液稀释制备成7个浓度梯度的样品，分别为6×107、2.4×107、1.8×107、1.2×107、6×106、3×106和1.2×106 CFU/L。为研究冻干对经不同方法处理后的蓝藻细胞的破碎效果，将蓝藻样品分为两组，一组将一定体积的蓝藻真空抽滤到孔径为0.45 μmGF/C膜上，将抽滤后的样品置于15 mL离心管中；另一组则直接取同样体积的蓝藻于15 mL离心管中。为比较研究冻融和冻干对蓝藻细胞的破碎效率，冻融或冻干结束后，将离心管中加入与抽滤前藻液等体积的去离子水，显微镜下计数，并计算蓝藻细胞的破碎效率。研究冻融和冻干对巢湖新鲜水华蓝藻破碎效果的方法与实验室培养蓝藻方法相同。

1.3 藻蓝蛋白提取

为研究不同提取剂对蓝藻蛋白的提取效率的影响，将抽滤后的蓝藻分别经冻融破碎和冻干破碎后，分成3组，添加不同的提取剂：去离子水、0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液和0.05 mol/L的Tris试剂；为研究提取剂添加顺序对藻蓝蛋白提取效率的影响，将真空抽滤后的蓝藻分为两组，一组添加提取剂之后放入冰箱冷冻，另一组按照上述的方法完成冻融后添加磷酸盐提取剂，4 ℃下避光提取12 h，在4 ℃下、8 000 r/min离心10 min取上清液，用RF-5301PC型荧光分光光度计（日本岛津制作所）测定提取液中藻蓝蛋白荧光强度。

1.4 藻蓝蛋白荧光强度的测定方法

调节荧光分光光度计的时间进程模式，设置激发波长为620 nm，发射波长为647 nm，扫描速度为Medium，采样间隔1 nm，激发和发射狭缝宽度为5 nm，响应时间为2 s。

1.5 藻蓝蛋白浓度与提取效率计算方法

通过计算单位蓝藻细胞中提取出藻蓝蛋白的含量来表示提取效率，通过此方法来探究不同试验条件下藻蓝蛋白的提取效率，计算方法参照季健[24]的研究。

2 结果与分析

2.1 冻融破碎试验

2.1.1 冷冻温度和冻融次数对藻蓝蛋白提取效率的影响 在不同冷冻温度下，随着冻融次数的增加，藻蓝蛋白的提取效率总体呈下降趋势（图1）。藻蓝蛋白在冻融过程中会产生不同程度的损失，2次冻融后，藻蓝蛋白的提取效率可达到最大值。在不同温度下，完成2次冻融后，单位蓝藻细胞中提取出来的藻蓝蛋白含量基本相同。因此，对于实验室培养的单种藻，改变冷冻温度对藻蓝蛋白的提取效率没有明显影响。

2.1.2 不同蓝藻浓度对藻蓝蛋白提取效率的影响 藻蓝蛋白的提取效率随蓝藻浓度增加呈对数增长趋势（图2），蓝藻浓度小于1.8×107 CFU/L时，藻蓝蛋白提取效率随着蓝藻浓度的增大而迅速增长；蓝藻浓度继续增加，藻蓝蛋白提取效率增长速度下降，值为0.2 ng/cell左右。原因可能是随着蓝藻浓度的增大，滤膜上的蓝藻细胞出现破碎不完全的情况，从而影响藻蓝蛋白的提取效率。

2.1.3 不同種类水华蓝藻和不同提取剂对藻蓝蛋白提取效率的影响 图3为冻融条件下不同种类的水华蓝藻（M.A、M.F、M.W、A.s）和采用不同提取剂对藻蓝蛋白提取效率的影响。由图3可知，对于实验室培养的4种蓝藻，去离子水的提取效果均远高于目前研究[15，17，25，26]中常用的磷酸盐缓冲溶液、Tris-base试剂和Acolectin-CHAPS缓冲液；其中使用去离子水的铜绿微囊藻的藻蓝蛋白提取效率最高，为0.13 ng/cell（9 538.14 μg/L）。Zimba等[25]将Acolectin（大豆磷脂）溶于CHAPS中，制成Acolectin-CHAPS（AC）缓冲液来提取隐藻和红藻中的藻胆蛋白，提取效率在38%～80%（800～1 000 μg/L）之间。庞晓宇等[16]也提出AC缓冲溶液对藻蓝蛋白的提取效率较高，但该缓冲液制备过程复杂且不宜保存，而且缓冲剂本身的颜色对试验结果有一定影响，不宜大规模推广应用。

2.1.4 提取剂添加顺序对藻蓝蛋白提取效率的影响 对于实验室培养的单种藻，提取剂在冻融前添加与冻融后添加对藻蓝蛋白的提取效率基本相同，两次试验结果均无显著性差异（P<0.05）（图4）。这与张静等[20]研究结果一致，即提取剂的添加顺序对实验室培养的蓝藻的藻蓝蛋白提取效率没有显著影响。

2.2 冻干破碎试验

2.2.1 不同种类的水华蓝藻和不同提取剂对藻蓝蛋白提取效率的影响 取实验室培养的4种蓝藻，真空抽滤、冷冻干燥后，分成三组，添加不同提取剂0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PB）、0.05 mol/L Tris-base试剂、去离子水。4种蓝藻藻蓝蛋白的提取结果与冻融试验结果一致。4种水华蓝藻中，铜绿微囊藻的藻蓝蛋白提取效率最高；3种提取剂中，去离子水对单位蓝藻中藻蓝蛋白的提取率最大（图5）。比较图5和图3可知，冻干试验单位铜绿微囊藻细胞中最多可提取出0.28 ng藻蓝蛋白，是冻融法提取效率的2.15倍。由此可推断，同样试验条件下冻干法比反复冻融法对蓝藻细胞破碎效率高。endprint

2.2.2 抽滤对藻蓝蛋白提取效率的影响 在提取藻蓝蛋白时，如何处理试验用藻对试验结果极其重要。由图6可知，采用去离子水作为提取剂，把蓝藻抽滤到滤膜上，在实验室培养的4种水华蓝藻中，藻蓝蛋白的提取效率比直接取藻液进行冷冻干燥的效率要高；抽滤后，单位铜绿微囊藻细胞中提取出藻蓝蛋白的含量是未抽滤的3倍。即在冷冻干燥试验中，藻浆的含水率对藻蓝蛋白提取的效率影响显著。含水率低的藻液冻干后蓝藻细胞破碎效率高于含水率高的蓝藻，且冻干所用的时间短，减少了藻蓝蛋白在试验过程中的损失。由此推断，藻液的含水率对冻干法的细胞破碎效率有一定影响。因此，藻液的最佳含水率成为提高冻干法破碎效率的重要因素。

2.2.3 不同銅绿微囊藻浓度对藻蓝蛋白提取效率的影响 根据上述试验结果可知，利用冻干法破碎蓝藻时应将蓝藻抽滤到0.45 μm GF/C膜上，因此，取实验室培养的铜绿微囊藻，显微镜下计数后，将藻液稀释至不同倍数，每组取一定体积的藻液真空抽滤到孔径为0.45 μm GF/C膜上，冷冻后置于冷冻干燥机中冻干，以去离子水作为提取剂，提取后离心取上清液在荧光分光光度计下测定藻蓝蛋白，结果如图7所示，藻蓝蛋白的提取效率随铜绿微囊藻浓度的增大而呈对数增长趋势，当铜绿微囊藻浓度大于3×107 CFU/L时，蓝藻细胞破碎效率呈降低趋势，因此藻蓝蛋白提取效率的增长速度下降。

2.3 对比冻干与冻融对藻蓝蛋白提取效率的影响

对于实验室培养的蓝藻，尤其是铜绿微囊藻，冻干破碎后对藻蓝蛋白的提取效率明显高于冻融；对于惠氏微囊藻和水华微囊藻，冻干和冻融后藻蓝蛋白的提取效率基本一致（图8）。对于不同浓度的铜绿微囊藻，在蓝藻浓度小于2×107 CFU/L时，采用冻融破碎蓝藻，藻蓝蛋白的提取效率稍高于冻干；当蓝藻浓度增加时，冻干得到的藻蓝蛋白浓度明显高于冻融。因此，若大规模提取藻蓝蛋白时，冻干破碎干燥法优于反复冻融破碎。

2.4 蓝藻细胞破碎效率试验

冻融破碎和冻干破碎后的藻屑在显微镜下观察结果如图9所示，图9A是没有进行破碎处理的原藻液，细胞呈透亮规则圆形；图9B是冻融破碎后的藻屑，可以看出还有一部分蓝藻细胞没有破碎；图9C是冻干破碎后的蓝藻，几乎没有完整的细胞形态，由此可知，冷冻干燥对蓝藻细胞的破壁效率高于反复冻融法，上述结论得到验证。

2.5 可行性验证

上述试验结果表明，对实验室培养的单种藻中藻蓝蛋白的提取效率来说，去离子水的提取效率最高，冻干破碎比冻融对蓝藻细胞破碎效率高。为验证试验方法准确性，取巢湖新鲜水华蓝藻按上述方法提取野生蓝藻中藻蓝蛋白，结果如图10所示。对于不同浓度的水华蓝藻，不论是冻融破碎还是冻干破碎，去离子水的提取效率均高于其他两种提取剂；且以去离子水为提取剂时，冻干的提取效率仍高于冻融。因此，由实验室培养的单种藻所得出的结论对于野外蓝藻来说确实可行。

3 结论

1）通过对藻屑的显微镜检及控制相同试验条件下藻蓝蛋白的提取效率可知，冻干法对蓝藻细胞的破碎效率高于反复冻融法。

2）控制破碎方法及其他试验条件不变，对比去离子水、磷酸盐溶液和Tris试剂对藻蓝蛋白的提取效率发现，去离子水对藻蓝蛋白的提取效率最高。

3）冻融试验中，冷冻温度与提取剂添加顺序对蓝藻细胞破碎率无显著影响。在冻干试验中，蓝藻真空抽滤在滤膜上能提高藻蓝蛋白的破碎率。

综上所述，采用荧光检测法测定藻蓝蛋白时，高效的前处理技术不仅为在湖泊环境监测中能实现快速准确定量蓝藻的生物量提供可能，同时对蓝藻水华的预防和控制也起到积极作用。

参考文献：

[1] BRODY M，EMERSON R. The effect of wavelength intensity of light on the proportion of pigments in porphyridium cruentum[J].American Journal of Botany，1959，46（6）：433-440.

[2] HORV？魣TH H，KOV？魣CS A W，RIDDICK C，et al. Extraction methods for phycocyanin determination in freshwater filamentous cyanobacteria and their application in a shallow lake[J].European Journal of Phycology，2013，48（3）：278-286.

[3] 瞿文川，潘红玺，苏晨伟.紫外可见分光光度法对湖泊沉积物中的色素测定[J].分析测试技术与仪器，1995（4）：36-39.

[4] SOMA Y，TANAKA A，SOMA M，et al. Photosynthetic pigments and perylene in the sediments of southern basin of lake Baikal[J].Organic Geochemistry，1996，24（5）：553-561.

[5] 阎 荣，孔繁翔，韩小波.太湖底泥表层越冬藻类群落动态的荧光分析法初步研究[J].湖泊科学，2004，16（2）：163-168.

[6] KASINAK J-M E，HOLT B M，CHISLOCK M F，et al. Benchtop fluorometry of phycocyanin as a rapid approach for estimating cyanobacterial biovolume[J].Journal of Plankton Research，2015， 37（1）：248-257.endprint

[7] LEE T Y，TSUZUKI M，TAKEUCHI T，et al. Quantitative determination of cyanobacteria in mixed phytoplankton assemblages by an in vivo fluorimetric method[J].Analytica Chimica Acta， 1995，302（1）：81-87.

[8] BASTIEN C，CARDIN R，VEILLEUX，et al. Performance evaluation of phycocyanin probes for the monitoring of cyanobacteria[J].Journal of Environmental Monitoring，2011，13（1）：110-118.

[9] CHANG D-W，HOBSON P，BURCH M，et al. Measurement of cyanobacteria using in-vivo fluoroscopy-effect of cyanobacterial species，pigments，and colonies[J].Water research，2012，46（16）：5037-5048.

[10] 陳纬栋，王 崇，胡晓芳，等.应用荧光分析技术检测蓝藻生物量[J].净水技术，2010（6）：80-84.

[11] KONG Y，LOU I，ZHANG Y，et al. Using an online phycocyanin fluorescence probe for rapid monitoring of cyanobacteria in Macau freshwater reservoir[J].Hydrobiologia，2014，741（1）：33-49.

[12] LEE T，TSUZUKI M，TAKEUCHI T，et al. In vivo fluorometric method for early detection of cyanobacterial waterblooms[J].Journal of Applied Phycology，1994，6（5-6）：489-495.

[13] IZYDORCZYK K，TARCZYNSKA M，JURCZAK T，et al. Measurement of phycocyanin fluorescenceas an online early warning system for cyanobacteria in reservoir intake water[J].Environmental Toxicology，2005，20（4）：425-430.

[14] AFTARI R V，REZAEI K，MORTAZAVI A，et al. Antioxidant activity optimisation of Spirulina platensis C-phycocyanin obtained from conventional，microwave-assisted and ultrasound-assisted extraction methods[J].Quality Assurance and Safety of Crops & Foods，2015，9（1）：1-9.

[15] VISKARI P J，COLYER C L. Rapid extraction of phycobiliproteins from cultured cyanobacteria samples[J].Analytical biochemistry，2003，319（2）：263-271.

[16] 庞晓宇，段洪涛，张玉超，等.富营养化湖泊水体中藻蓝蛋白提取方法的对比[J].湖泊科学，2014，26（5）：799-806.

[17] 赵冰冰，张发宇，陈 裕，等.不同冻融条件对破壁提取巢湖水华新鲜蓝藻中藻蓝蛋白的影响[J].安徽农业科学，2014，42（17）：5345-5347.

[18] 高 瑾.太湖水华蓝藻中藻蓝蛋白的富集分离[D].江苏无锡：江南大学，2009.

[19] 张 静，韦玉春，王国祥，等.太湖蓝藻水样中藻蓝蛋白提取方法比较[J].湖泊科学，2013，25（2）：283-288.

[20] 张 静，韦玉春，王国祥，等.实验条件对太湖水体中藻蓝蛋白提取结果的影响[J].环境科学与技术，2012（10）：7-11.

[21] LAWRENZ E，FEDEWA E J，RICHARDSON T L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts[J].Journal of Applied Phycology，2011，23（5）：865-871.

[22] PATIL G，CHETHANA S，SRIDEVI A S，et al. Method to obtain C-phycocyanin of high purity[J].Journal of Chromatography A，2006，1127（1-2）：76-81.

[23] WILLIAMS R J，SHAW S K.The relationship between cell injury and osmotic volume reduction：II. Red cell lysis correlates with cell volume rather than intracellular salt concentration[J].Cryobiology，1980，17（6）：530-539.

[24] 季 健，孔繁翔，于 洋.太湖越冬蓝藻空间分布的初步研究[J].湖泊科学，2009，21（4）：490-494.

[25] ZIMBA P V.An improved phycobilin extraction method[J].Harmful Algae，2012，17（17）：35-39.

[26] CHETHANA S，NAYAK C A，MADHUSUDHAN M C，et al. Single step aqueous two-phase extraction for downstream processing of C-phycocyanin from Spirulina platensis[J].Journal of Food Science And Technology，2015，52（4）：2415-2421.endprint