一株植物内生菌的化感作用测定

2017-09-06郁天臣张延浩何中琼

现代农业科技 2017年14期

郁天臣　张延浩　何中琼

摘要采用培养皿培育法，检测加拿大一枝黄花内生黑曲霉CHH-S1发酵菌液对4种作物种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明，内生黑曲霉的发酵液能降低油菜、油麦菜和芝麻种子的发芽率，不同浓度的菌液可显著抑制4种受体植物籽苗的鲜重、根长和可溶性蛋白含量的增长，并表现出一定的浓度依赖性。油麦菜和芝麻籽苗内可溶性多糖含量受菌液刺激而增高，苋菜和油菜幼苗中的多糖含量则受到明显抑制作用。以上结果表明，加拿大一枝黄花的内生菌具有良好的化感作用。

关键词植物内生菌；黑曲霉；化感作用；幼苗；发芽率

中图分类号 Q948.12 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）14-0092-03

Abstract The effects of the fermentation broth of Aspergillus niger CHH-S1，an endophytic fungus isolated from the Solidago canadensis L.，on the seed germination and seedling growth of four crops were studied by petri dish culture method.The results showed that the broth of endophytic Aspergillus niger could reduce the germination rate of rape，lettuce and sesame seeds，and different concentrations of the broth could decrease the fresh weight，root length and the content of soluble protein in four kinds of receptor plants seedlings.The effects were stronger with the broth concentration increased.The content of polysaccharide in the lettuce and sesame seedling were increased by dealing with the broth，and the contents in the leaf lettuce and rape seedlings were just inverse.These results showed that the endophytic fungus CHH-S1 of Solidago canadensis L. had allelopathic effect on other plants.

Key words endophytic fungus；Aspergillus niger；allelopathy；seedling；germination rate

化感作用是外来植物成功入侵，并造成本土生物多样性破坏的重要机理之一[1]。加拿大一枝黄花作为一种典型入侵物种，其不同组织的水或醇提取物对小麦、玉米等多种本地植物均表现出明显的化感抑制作用[2-5]，在我国已成为非常严重的“生态杀手”。

化感作用不仅存在于植物之间，已有研究表明，植物根际及正常组织中的微生物通过产生特定的代谢产物，也可以影响周边植物或微生物的生長[6-8]。对禾草、紫茎泽兰等植物的研究表明，植物内生真菌可以提高宿主植物抗逆境能力，促进宿主种子发芽和幼苗存活，从而增强宿主植物对周边植物的竞争力，提高植物的入侵能力[9-10]。从核桃、胡桃、水稻及黑麦等植物中分离的内生菌，其发酵液同样表现出对小麦、稗草、豆科植物等供试植物生长（芽或根）或病原菌生长的抑制作用[11-15]。但尚未见对加拿大一枝花内生菌作用的研究，本试验通过对加拿大一枝黄花内生菌化感作用的研究，希望为进一步了解该植物的入侵机制和开发新型生物农药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验仪器及试剂

试验试剂均为分析纯，购自国药化学试剂有限公司。芝麻、油麦菜、苋菜和油菜种子购自镇江七里甸农贸市场。试验仪器包括SW-CJ-IF超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、DHZ-052D恒温震荡摇床（上海博彩生物科技有限公司）、TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）、N-1100V旋转蒸发仪（东京理化）和SPX-250B-D光照培养箱（上海予腾生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 内生菌株的发酵。内生菌株CHH-S1为分离自加拿大一枝黄花茎组织的一株黑曲霉。采用PDA平板进行菌株活化，25 ℃恒温培养3～5 d。接入ME液体培养基中发酵，取100 mL置于250 mL锥形瓶，在28 ℃条件下120 r/min发酵14 d，过滤得到菌液和菌体。对菌液进行重复过滤，保存备用。

1.2.2 种子发芽试验。用2%次氯酸钠浸泡苋菜、油麦菜、油菜和芝麻种子10 min，蒸馏水冲洗3遍，浸泡5 h后备用。在无菌的9 cm 培养皿中放入双层滤纸，以2 mL发酵液浸润滤纸，将30粒健康种子均匀分布在滤纸上。以蒸馏水处理作为对照，每种种子做3个平行试验，测定其发芽率。培养条件设定为温度（24±1）℃、光照周期12 h/12 h，连续培养6 d。记录每天种子发芽数（以芽长2 mm以上为发芽），按以下公式进行发芽指标测定：

发芽率（%）=（发芽的种子数/供检测的种子数）×100；

发芽指数（GI）=∑（Gt/Dt）；

抑制率（%）=（对照组数据-处理组数据）/对照数据×100。

式中，Dt—发芽天数，Gt—与发芽天数相对应的当日发芽数目。endprint

1.2.3 菌株化感作用测定。将4种植物种子于20 ℃条件下水浸润催芽，12 h后选取发芽状态一致的种子各30粒，以分别稀释1倍（1/2 S1）、4倍（1/4 S1）和8倍（1/8 S1）的发酵液和无菌水分别处理4 d，观测芽长、根长、根重以及芽重的差异。培养结束后每个培养皿选取10株发芽幼苗，测定各株的根长、芽长、株重和干重，取各组平均值进行比较。幼芽中多糖含量采用硫酸蒽酮比色法测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定[16]。

1.3 数据分析

统计3组观测值数据，并采用SPSS 18.0 统计软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 菌株发酵液对4种植物种子发芽的影响

CHH-S1发酵液处理4种植物种子6 d后，芝麻、油菜和油麦菜种子的相对发芽率分别为28.6%、51.2%和26.0%，明显低于对照组，而苋菜种子的相对发芽率则略高于对照组。相对发芽指数略高于相对发芽率，但与后者有相似的变化特点，除苋菜种子外，其他3种作物种子的萌发均受到CHH-S1菌株发酵液的抑制（图1）。

2.2 菌株发酵液对植物幼苗生长的影响

以3种不同稀释倍数的菌液（1/2 S1、1/4 S1和1/8 S1）分别处理作物预萌发种子，4种作物萌发幼苗的生长表现出明显的浓度依赖性，菌液浓度越高，萌发种子生长受到的抑制作用越强，幼苗的长度和生物量均显著低于以蒸馏水处理的对照组（图2、3、4）。

1/2 S1及1/4 S1的发酵液处理组的种子几乎不见明显生长。1/8 S1处理后的芝麻、苋菜和油麦菜的种子虽有生长，但幼芽末端变红，根出现萎蔫；油菜的萌发幼苗则基本没有生长（图2）。数据分析表明，4个种子处理组的根长均与对照组根长有显著差异（P<0.05），但油菜幼苗对发酵液浓度变化敏感，且具有明显的浓度依赖性。油麦菜和芝麻幼苗在各稀释浓度处理组间的根长则无明显差异（图3）。苋菜种子试验组中，中低浓度（1/4 S1和1/8 S1）与高浓度组间差异显著（P<0.05）。4种植物幼苗经不同浓度发酵液处理后，其鲜重与对照组均存在显著差异，但均未表现出浓度依赖性（图4）。

2.3 菌株CHH-S1对幼苗生理生化指标的影响

种子萌发后，通过营养物质的转化以提供幼苗生长所需。因此，其中的营养物质组成会发生一定变化。采集培育6 d后的植物幼苗，按照文献[16]方法进行组织中可溶性多糖和蛋白含量的测定。由图5可知，菌株的各浓度菌液可以促进油麦菜和芝麻幼苗中多糖含量增加，減少苋菜和油菜幼苗组织中可溶性多糖物质的含量。油麦菜种子试验组中，籽苗中的多糖含量排列如下：1/8 S1（13.34 mg/g）>1/2 S1（13.01 mg/g）>1/4 S1（5.39 mg/g）>CK（2.72 mg/g）。芝麻种子试验组中，组内两两之间均存在显著差异，且1/2 S1>1/8 S1>1/4 S1，种子受菌液促进效果最强（1/2 S1）时，籽苗中多糖含量为对照组的924.78%。苋菜和油麦菜种子试验组的中低浓度组（1/8 S1和1/4 S1）组间的多糖含量无显著差异；高浓度处理组中，苋菜中多糖含量较对照组减少96.04%，油菜组则减少92.12%，表现出明显的抑制性。

由图6可知，油麦菜种子试验组中，随着发酵液浓度的升高，蛋白含量受抑制效果不断加强；1/2 S1浓度时，受抑制效果最强，抑制率为71.14%。油菜和苋菜种子试验组中，1/4 S1浓度时，蛋白含量最低，抑制率分别是61.32%和89.72%。而芝麻种子试验组，浓度为1/8时，蛋白含量最低，抑制率为73.60%。

3 讨论

植物可以通过化感作用影响周边其他植物的生长，而存活于植物组织内部的内生菌可以通过提高宿主的抗病力、增强其对不良生态因子的耐受性等作用直接或间接促进宿主植物的竞争力，并在抑制其他植物种子萌发及幼苗生长中发挥作用。杨晨从紫茎泽兰的健康组织中分离得到多株内生菌，其中某些优势内共生真菌能促进紫茎泽兰种子的发芽和幼苗的存活，从而促进宿主植物更快地建立起种群[11]。王静等发现紫茎泽兰的部分内生真菌表现出良好的除草活性，可以抑制高粱、小麦、黄瓜、油菜等作物根系的生长[12]。本试验从加拿大一枝黄花组织中得到一株内生黑曲霉CHH-S1，其发酵液对芝麻、油菜、苋菜和油麦菜4种作物种子发芽表现出一定的抑制作用，以上结果均表明入侵植物的内生菌对宿主外受体植物具有化感作用。携带内生菌的宿主植物可以表现出更强的化感作用，杨松等发现披碱草内生真菌对黑麦草、高羊茅和草地早熟禾3种草坪种子的萌发具有一定的抑制作用[17]，黄玺等发现带菌醉马草浸提液对针茅和硬质早熟禾的种子萌发和幼苗生长有抑制作用，并且随着质量浓度的增加抑制作用增强[18]。内生菌的发酵产物也具有一定的化感作用。黄湘海发现黑核桃内菌生真HJI的发酵产物对3 种受体种子（小麦、油菜、萝卜）生长具有一定的抑制作用。王静等发现侧柏内生真菌链格孢菌（Alternaria alternaria）对反枝苋种子幼根的生长表现出较强的抑制作用，其中有8株的抑制率在70%以上。来源于强化感水稻的内生菌塔宾曲霉、粘红酵母发酵产物均可显著抑制稗草的生长[15]。因此，植物内生菌可作为潜在生物除草剂的来源。

加拿大一枝花内生黑曲霉CHH-S1菌株的发酵液能明显抑制4个种子籽苗的鲜重、根长和蛋白含量，4种受体种子籽苗的鲜重对发酵液的浓度变化不敏感，处理组间无显著差异（P>0.05）。菌液对籽苗根伸长的抑制效果随着浓度的降低而减弱，且4个种子处理组均与对照组间有显著差异（P<0.05）。不同浓度的菌液对4个种子籽苗内的蛋白含量具有显著抑制性，且不同处理组间存在显著差异性（P<0.05）。其中，芝麻种子对菌液的敏感性最强。对于多糖含量来说，油麦菜和芝麻幼苗中的多糖物质受菌液刺激而含量增加，但苋菜和油菜幼苗中的多糖物质含量则受到明显抑制作用。对于内生菌产物中具体的作用物质还需要进一步试验进行分离和检验。endprint

4 参考文献

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