血浆同型半胱氨酸及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与广西玉林地区汉族原发性高血压患者的关系

2017-09-06赵艳梅李平许为炎谢文超林智海黄翠娟梁萍刘康海

中国心血管病研究 2017年6期

赵艳梅李平许为炎谢文超林智海黄翠娟梁萍刘康海

临床研究

赵艳梅李平许为炎谢文超林智海黄翠娟梁萍刘康海

目的探讨广西玉林地区汉族原发性高血压（EH）患者血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平及其代谢酶N5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T基因多态性的临床意义。方法选择玉林汉族原发性高血压患者200例作为EH组，健康体检血压正常者200例作为对照组（NT组）。所有受试者抽取外周静脉血用全自动生化分析仪检测Hcy及其他生化指标的水平；同时提取DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法检测两组MTHFR C677T基因型。结果两组Hcy水平比较差异有统计学意义（P＜0.05）。CC、CT、TT三种基因型频率表达在EH组和NT组中分别为27%、49.5%、23.5%和40%、45.5%、14.5%，CT突变频率高；EH组中C和T等位基因为51.75%和48.25%，NT组中为62.75%和37.25%。两组三种基因型总体频率及等位基因频率分布差异有统计学意义（P＜0.05），两组TT型及T等位基因频率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。EH组中TT型Hcy水平高于CC型和CT型。Logistic回归显示，CT+TT基因型、Hcy可能为EH的危险因素。结论 Hcy水平升高及MTHFR C677T基因多态性可能与广西玉林地区汉族EH的发生有关。T等位基因可能为该人群易感基因，二者可能对该地区EH的预测、诊疗有一定临床价值。

同型半胱氨酸；亚甲基四氢叶酸还原酶；基因多态性；高血压；广西玉林地区汉族

原发性高血压（EH）是常见心血管疾病，可由多种因素引起，其发病率、致死率逐年增加。高血压的主要危险因素有年龄、吸烟、血脂异常、糖耐量受损或糖尿病、早发心血管病家族史、肥胖、同型半胱氨酸（Hcy）升高等。有研究表明，Hcy水平升高可引起内皮细胞损伤、破坏血管壁胶原纤维、诱导细胞凋亡、促进斑块钙化，这些改变可能参与高血压的发病。Hcy水平升高有很多因素，如遗传、年龄、种族、性别、肾功能、药物等。有学者[1]认为，高同型半胱氨酸血症是心脑血管疾病发生的独立危险因素。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是Hcy代谢的关键酶。MTHFR基因677碱基C/T突变影响MTHFR活性，进而影响Hcy代谢。MTHFR基因677碱基C/T突变，受很多因素影响，比如种族、地域，而其多态性与EH的关系在国内外报道不尽相同。本研究主要讨论Hcy、MTHFR基因C677T多态性与广西玉林地区汉族人群EH的关联性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 ①EH组：2014年1月至2015年5月在玉林市第一人民医院住院治疗的 EH患者200例，男性115例，女性85例，平均年龄（49.695±9.499）岁。入选标准：按照中国高血压防治指南（2005年修订）制定的高血压诊断标准[2]，收缩压≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和（或）舒张压≥90 mm Hg，以及正在服用降压药的高血压患者。②NT组：采取随机对照试验，随机抽取同期来我院的健康体检者200例，男性90例，女性110例，平均年龄（47.935±8.896）岁。入选标准：收缩压＜140 mm Hg和舒张压＜90 mm Hg，未服用降压药，无高血压家族史。两组排除标准：排除继发性高血压、糖尿病、心力衰竭、自身免疫性疾病、药源性疾病、服用避孕药、妊娠和哺乳期妇女及其他恶性疾病患者。所有研究对象均来自广西玉林地区无血缘关系的汉族人群。所有对象自愿参加，并签订知情同意书。本课题方案经玉林市第一人民医院伦理委员讨论通过。

1.2 标本收集抽取空腹9～12 h肘静脉血10 ml。一管用EDTA抗凝，混匀-80℃保存，供提取基因组DNA使用；另一管肝素抗凝，供生化指标检测。

1.3 检测血浆同型半胱氨酸（Hcy）及各项生化指标采用罗氏Cobas-8000生化分析仪，通过循环酶法测定Hcy。该方法测定时间短、精密度高、抗干扰等方面可满足临床检测[3]；同时采用比色法测定尿素、肌酐、尿酸、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）；采用己糖激酶法测定空腹血糖（GLU）。其检测试剂均为德国罗氏生产。Hcy正常参考值设定为≤10μmol/L。

1.4 MTHFR C677T基因分型

1.4.1 DNA提取 EDTA抗凝血100μl，使用亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C/T检测试剂盒（PCRRFLP，深圳奥萨制药有限公司提供）提取 DNA，于-20℃保存。

1.4.2 PCR扩增及检测引物设计使用Primer 3 Input网络软件，上游引物：5′-ATGACCTGCTGCCGTCAGCG-3′，下游引物：5′-CCGCAACTATGGCATCGAGC-3′，反应体系为25μl。设定好条件，应用PCR基因扩增仪进行扩增，然后进行酶切分析，凝胶电泳检测，最后在凝胶成像仪下观察并照相，进行基因分型。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以频数表示，组间比较采用卡方检验；多组间（MTHFR C677T不同基因型间Hcy水平的比较）比较采用方差分析；评价高血压危险因素采用Logistic回归分析；采用Hardy-Weinberg平衡法检测样本是否有群体代表性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EH组和NT组的一般资料比较两组年龄、尿素、肌酐、尿酸、GLU、HDL-C比较未见统计学差异（P＞0.05）；而收缩压、舒张压、TG、TC 和 LDL-C EH组患者均明显高于NT组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表 1。

2.2 两组Hcy水平比较 EH组Hcy水平为（19.739±5.908）μmol/L，显著高于 NT组的（6.785±1.835）μmol/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 MTHFR C677T基因型鉴定结果 PCR扩增后再经 HinfⅠ内切酶酶切，37℃温育后,再经2%琼脂糖凝胶电泳检测，成像仪下得到三种基因型:野生CC基因型为一个274 bp的片段，凝胶成像仪下见一个274 bp条带；杂合突变CT基因型，即酶切后产生的274 bp、228 bp和46 bp三个片段，成像仪下可见274 bp和228 bp两个条带；纯合突变TT基因型，即酶切后产生的228 bp和46 bp两个片段，成像仪下仅见一个228 bp的条带。见图1。

图1 MTHFR C677T的基因型的RFLP酶切电泳图

2.4 Hardy-Weinberg平衡检验对400例样本MTHFR C677T基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验，结果提示两组基因型均符合遗传平衡定律，说明该样本在遗传学上具有较好的群体代表性。

2.5 两组MTHFR基因型和等位基因比较经过检测两组C677T均表达CC、CT和TT三种基因型。EH组分别为27.0%、49.5%和23.5%，C和T等位基因频率分别为51.75%和48.25%。NT组分别为40%、45.5%和14.5%，C和T等位基因频率分别为62.75%和37.25%。两组中三种基因型总体分布频率差异有统计学意义（χ2=9.645，P=0.008）；TT 型基因频率及T等位基因频率在EH组中均高于NT组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 两组一般资料比较（±s）

注：EH：高血压；NT：对照组；GLU：空腹血糖；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白；LDL-C：低密度脂蛋白

组别例数年龄（岁）LDL-C（mmol/L）NT 组 200 47.94±8.90 118.91±9.12 74.66±6.86 4.47±1.08 71.33±15.59 294.08±70.78 4.91±0.47 1.04±0.42 4.79±0.67 1.72±0.42 2.55±0.61 EH 组 200 49.70±9.50 165.87±12.60 94.40±6.58 4.51±0.97 70.09±13.83 296.05±63.61 4.88±0.38 1.92±0.46 6.02±0.56 1.66±0.39 3.64±0.56 P值＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01收缩压（mm Hg）舒张压（mm Hg）尿素（mmol/L）肌酐（μmol/L）尿酸（μmol/L）GLU（mmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）

表2 EH组与NT组MTHFR C677T基因型和等位基因比较[例数及百分率（%）]

2.6 高血压组MTHFR C677T不同基因型间Hcy水平的比较采用方差分析比较EH不同MTHFR基因型血浆 Hcy水平，TT 型为（21.68±5.97）μmol/L，CT 型为（20.16±5.40）μmol/L、CC 型为（17.38±5.47）μmol/L。TT型Hcy水平高于CC型和CT型，差异有统计学意义（P均＜0.05）。

2.7 Logistic回归分析以是否患有高血压为应变量，将基因型（CC 型，CT+TT型）、Hcy、尿素、肌酐、尿酸、GLU、TG、TC、LDL-C 和 HDL-C 引入模型。调整主要的混杂因素（年龄、性别、体重指数），采用逐步Logistic回归方法，结果显示，CT+TT基因型、Hcy、TG、TC、LDL-C为EH的危险因素。见表3。

表3 多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

高血压是引发心脑血管疾病的高危因素，而高Hcy血症是引起动脉粥样硬化及相关并发症的危险因素[4]，其水平可反映高血压患者的动脉病变，如颈动脉斑块的厚度及左心室肥厚的严重程度[5]，故二者发展关系密切，可共同促进心脑血管疾病的发生。Hcy是一种含硫氨基酸，是由duVingeaud在1931年发现的，在人体内不能合成，是蛋氨酸的中间代谢产物，其水平受多种因素影响，如遗传、性别、年龄、药物、其他疾病等。庞鸿瑞等[6]的研究发现，新疆哈萨克族人Hcy水平存在年龄、性别差异。但本研究发现Hcy水平与年龄无关，Hcy水平与种族、地域相关。Hcy的升高可通过上调血管内皮细胞中Fas分子，使血管内皮素-1增多，进而引起血管内皮细胞功能紊乱[7]；通过内质网应激增加caspase-3的活性诱导祖细胞凋亡致动脉硬化、血管平滑肌增生[8]，同时可促进胶原纤维合成及平滑肌细胞增殖，进而引发动脉粥样硬化，可能与高血压的发病有关。李建平等[9]的研究发现，我国成年高血压患者伴有高Hcy血症者约占75%。贾建峰等[10]的研究亦表明，正常高值血压者Hcy水平高于正常血压者，且随着血清Hcy水平升高，其血压水平亦升高。MTHFR是Hcy再甲基化代谢途径中的关键酶。人类MTHFR基因定位于染色体1p36.3，全长17 kb，已发现具有高度多态性。当MTHFR发生错位突变（677C→T）置换，缬氨酸代替丙氨酸，使MTHFR对热不稳定、活性降低，引起Hcy代谢环节受阻进而引起Hcy升高[11]。因此，MTHFR基因发生突变引起Hcy升高，进而促进高血压的发生。张广森等[12]的研究发现，MTHFR C677T点突变可引起Hcy升高，进而促进血管损害。Andreassi等[13]报道，经冠状动脉造影确诊的冠心病患者MTHFR TT基因型个体Hcy水平高。本研究结果显示，在高血压患者中携带MTHFR TT基因型患者Hcy水平高于携带MTHFR CC/CT基因型患者。综上所述，MTHFR基因突变可影响体内Hcy水平。

关于MTHFR基因C677T位点多态性与EH的关系研究结果报道不一。Lwin等[14]在研究日本男性MTHFR基因C677T多态性与高血压的关系时，发现该基因多态性与高血压无关。刘建伟等[15]的研究也未确定MTHFR基因多态性与高血压有关。然而，Golledge等[16]对土耳其人研究发现，MTHFR基因C677T多态性是高血压的独立危险因素。邢绣荣等[17]的研究发现，MTHFR基因C677T多态性可能与北京城区汉族人群发生高血压有关。本课题研究结果显示，EH组和 NT组三种基因型的总体分布频率存在差异；TT基因型频率及T等位基因频率EH组均高于NT组。Logistic回归分析结果可以看出，MTHFR C677T基因多态性，主要是CT+TT基因型、Hcy与高血压有关，为EH的危险因素。由此可以推断，TT基因型及携带T等位基因的广西玉林地区汉族人群发生EH的风险较高。有研究[18]报道，宁夏回族EH人群TT基因型和T等位基因频率分别为22.6%和42.8%，河南汉族EH人群分别为12.3%和29.9%[19]。Nevin等[20]研究土耳其EH人群TT基因型和T等位基因频率分别为12.8%和33.3%。本研究发现，广西玉林地区汉族EH人群TT基因型和T等位基因频率分别为23.5%和48.25%，略高于以上地区，接近于宁夏回族EH人群。而对于健康人群C677T基因突变频率的高低亦有不同报道。Mejia等[21]研究发现，TT型突变频率马来西亚人为6.3%，澳大利亚白人为8.9%[22]。而Lin等[23]的研究发现，广西汉族人群TT基因型和T等位基因频率分别为11.0%和39.1%。本研究结果接近上述汉族人群。所以，不同地域、不同种族MTHFR基因C677T的突变频率存在一定差异。

总之，EH是一种多基因复杂疾病。本研究发现，Hcy升高及其代谢酶（MTHFR）C677T基因多态性可能与广西玉林地区汉族EH的发生有关，T等位基因可能为该人群易感基因。因此，对高血压患者的诊治应个体化，除控制危险因素外，还应检测Hcy及MTHFR C677T基因型，积极预防和治疗高Hcy血症，进一步控制心脑血管疾病的发生。国内外研究结果不同，可能与基因因素、环境因素、种族、研究样本量、统计方法等差异有关。有关高血压和Hcy及其代谢酶基因多态性的关系相对复杂，还需要以后进一步研究阐明相关机制。

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Relation of plasm homocysteine and methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms in patients with essential hypertension in Han in Yulin of Guangxi

ZHAO Yan-mei＊，LI Ping，XU Wei-yan，et al.＊Department of Cardiology，the First People′s Hospital of Yulin，Yulin 537000，China

LI Ping，E-mail：Gxylliping@126.com

Objective Discussion the relationship of plasma homocysteine（Hcy）levels and N 5，10-methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR）C677T polymorphism and essential hypertension in Han in Yulin of Guangxi.MethodsA total of 400 Han nationality of Yulin，peripheral blood in 200 EH patients and 200 normaltensive（NT）subjects.The homocysteine and other biochemical indicators levels were detected of automatic biochemical analyzer.Extracting DNA，the MTHFR C677T genotype in two groups were discover with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP）.ResultsHcy levels of the two groups was statistically significant（P＜0.05）.The frequency expressed of CC，CT，TT three genotypes in EH group and NT group,respectively 27%，49.5%，23.5%and 40%，45.5%，14.5%，CT high mutation frequency.The frequency of C and T allele was 51.75%and 48.25%in EH group，and 62.75%and 37.25%in NT group.Three genotype frequencies and allele genes of the two groups was statistically significant（P＜0.05）.The frequency of genotype TT and T allele of two groups was statistically significant（P＜0.05）.In EH group，the level of Hcy type TT was higher than that of type CC and type CT.Logistic regression showed that CT+TT genotype，Hcy may be a risk factor for EH.ConclusionElevated levels of Hcy and the MTHFR C677T gene polymorphism may be related to the occurrence of EH in the Han nationality in Yulin area of Guangxi，the T allele may be a susceptibility gene in this population.Hcy level，MTHFR C677T gene polymorphism may have a certain clinical value for the prediction and treatment of EH in the region.

Homocysteine； Methylenetetrahydrofolate reductase； Gene polymorphisms； Essential hypertension；Han nationality in Yulin of Guangxi