酒鬼酒酿造环境异常球菌属菌株的生物学特征及系统发育分析

2017-09-04贺建武黎有有杨玉婷李梦霖刘祝祥陈义光

微生物学杂志 2017年3期

贺建武, 黎有有, 杨玉婷, 樊林, 李梦霖, 余冰, 易旻, 刘祝祥, 陈义光*

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院, 湖南吉首 416000; 2. 吉首大学杜仲综合利用技术国家地方联合工程实验室,湖南吉首 416000；3.酒鬼酒股份有限公司, 湖南吉首 416000)

贺建武1,2, 黎有有3, 杨玉婷1, 樊林2, 李梦霖1, 余冰3, 易旻1, 刘祝祥1, 陈义光1*

研究对分离自馥郁香型白酒酒鬼酒制曲和发酵车间空气的8株异常球菌属(Deinococcus)菌株的特征及系统发育分析进行研究。采用添加体积分数10%酒鬼酒混合浸汁的营养琼脂培养基分离，挑选并纯化与异常球菌属菌株表型相似的菌株，考察其相关生理生化特征，并进行基于16S rRNA基因序列的系统发育分析。通过表型特点筛选，得到23株异常球菌属疑似菌株。系统发育分析表明，23株菌株中有8株属于异常球菌属，归属于该属的4个种(D.radiotolerans、D.daejeonensis、D.ficus和D.yunweiensis)。形态观察和生理生化实验表明，这些异常球菌属菌株在内生孢子、革兰染色、过氧化氢酶实验、生长温度范围、生长pH范围、多聚物水解等特征方面，与它们系统发育关系最为密切的典型菌株之间存在不同程度的差异。

白酒；酿造环境；异常球菌属；空气源微生物；系统发育分析

传统白酒酿造过程中，空气、原料、用水、场地、用具、设备，甚至人手及鞋等环境因素中都有功能微生物的参与[1-2]，酿酒环境空气聚集有大量有益于酿造的微生物，保持着独特且稳定的动态平衡，在形成风味独特且无法复制白酒香型方面发挥重要作用[3]。湖南吉首、贵州遵义、四川宜宾和泸州等地存在一个重要的微生物发酵带，出产了包括酒鬼酒、茅台酒、五粮液和泸州老窖等多种名酒[4]。以馥郁香型为特点的酒鬼酒生产基地位于武陵山区腹地湘西吉首市，其酿造环境中存在丰富的产淀粉酶和脂酶的微生物类群[5]，形成了与酒鬼酒特殊香型相适应的微生物区系。异常球菌属菌株是能对引起细胞致死效应的辐射有抵抗能力的细菌，有学者统计异常球菌属微生物的分离环境囊括了空气、土壤、水处理污泥、岩石、动物粪便、动物体及其肠道等[6]，在我国白酒的微生物区系研究中有只见到少量关于异常球菌纲的相关报道[7]。我们在对馥郁香型白酒酒鬼酒的空气源微生物进行相关分析时，从制曲车间和酿造车间空气中分离到较多的与异常球菌属表型特征接近的菌株。异常球菌属微生物在白酒酿造领域的应用开发中鲜见报道，这些菌株是否可能存在一些与酿酒相关的特殊生理特点？因此，对该批疑似异常球菌属菌株进行生物学特征观察和系统发育分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源样品分别采自酒鬼酒有限公司馥郁香型系列白酒制曲车间和发酵车间，采样方法为空气沉降法[8]，分别选取发酵车间室内四角和中央区域距墙30 cm以外区域，高度距地面1 m左右且无人员流动的范围为采样点，将装有培养基的采样皿暴露于空气中30 min后快速盖好皿盖，24 h内带回实验室，置于28 ℃恒温培养箱中培养。

1.1.2 培养基分离培养基：添加体积分数10%酒鬼酒混合浸汁的营养琼脂培养基NA(牛肉膏粉3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.4)，酒鬼酒混合浸汁由酒鬼酒糖化熟料、窖泥、黄水和腐殖土组成。产胞外酶基础液体培养基：蛋白胨1 g，酵母膏1 g，水1 000 mL；除尿素水解外，其余水解实验培养基pH调至7.5～8.0。

1.1.3 主要仪器及试剂 GNP-9050型恒温培养箱(上海精宏公司)，Moticam 2306型光学显微镜(Motic公司)，5810R型离心机(Eppendorf)，PE-9600型PCR仪(BIO-RAD公司)；细菌基因组DNA提取和纯化试剂、酶及细菌通用PCR引物均购自上海生工生物技术服务有限公司(Sangon)，其他分析试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 菌株形态特征根据菌落的颜色、大小、边缘、湿润度、透明度、与培养基结合程度等特征挑取培养皿上的单菌落进行四分体划线纯化。细胞形态用光学显微镜进行观察，菌株的表型特征、生理生化特性参照常见细菌鉴定系统手册[9]。

1.2.2 细菌DNA提取及PCR扩增 DNA提取及16S rRNA基因的PCR扩增参照Li等[10]使用的方法，通用引物Primer A 8-27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和Primer B 152-1504R：(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)，PCR产物用质量分数0.8%～1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行纯度测试后送上海生工生物技术服务有限公司进行16S rRNA基因序列测定。

1.2.3 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析将16S rRNA基因序列导入NCBI网站和EzTaxon server网站[11]在GenBank/EMBL/DDBJ等公共数据库中进行相似性序列搜索，选出同源性最高的相关典型菌株的16S rRNA基因序列组成序列集，通过软件包Clustal X[12]进行比对分析，使用BioEdit软件[13]进行序列剪辑，根据Kimura模型[14]估算系统进化距离矩阵；应用MEGA软件[15]，采用邻位相接法(Neighbour-Joining)进行系统进化树的构建；并用bootstrap法[16]重复取样1 000次自展以评估系统发育树的拓扑结构稳定性。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态特征

采用添加混合浸汁的NA培养基，从制曲和发酵车间空气源中分离培养共得到192株纯培养物，结合细菌鉴定手册[9]以及张玉琴等[17]报道的异常球菌属特点，挑选出细胞呈球形或短杆状、无鞭毛不具运动性，且菌落颜色呈鲜红、桔红或者粉红色的疑似异常球菌属(Deinococcus)菌株23株，其表型特征见表1。

表1 酒鬼酒制曲和发酵车间空气样品中疑似异常球菌属菌株的表型特征

2.2 系统发育分析

在与已发表的关于异常球菌属微生物形状描述对比的基础上，对23株可能为异常球菌属的菌株进行了16S rRNA基因序列扩增和测序，所得序列提交至GenBank注册。经在GenBank数据库中比对后确定其分类地位，结果显示23株疑似异常球菌中有8株(登录号见图1)与异常球菌-栖热菌群(Deinococcus-Thermus)异常球菌科(Deinococcaceae)的异常球菌属(Deinococcus)的菌株发育关系最为密切。

从系统发育树(图1)来看，JSM 2175016与异常球菌属典型菌株DeinococcusficusCC-FR2-10T的基因序列相似度为97.4%，JSM 2215060 与DeinococcusdaejeonensisMJ27T的基因序列相似度为97.9%，菌株JSM 2215109和JSM 2155001与该属的DeinococcusradiotoleransC1T发育关系最为密切，基因序列相似度分别为97.6%和96.9%，菌株JSM 2215105、JSM 2145010、JSM 2215108和JSM 2175012与该属的典型菌株DeinococcusyunweiensisYIM 007T以大于99%的16S rRNA基因序列相似度和极高的自展值(boostrap value, 100%)聚为进化树的一个稳定的分支。

图1 基于16S rRNA基因序列构建的8株异常球菌的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of 8 Deinococcus strains

2.3 生理生化特征

考察异常球菌属菌株JSM 2145010、JSM 2155001、JSM 2175012、JSM 2195006、JSM 2215105、JSM 2215108、JSM 2215109和JSM 22150608在5～50 ℃，pH 4～13范围内耐受范围，同时考察其内生孢子、革兰染色、过氧化氢酶、明胶液化、脂酶、脲酶等情况，结果见表2和表3。

表2显示菌株JSM 2175016、JSM 2215060、JSM 2215109和JSM 2155001 与各自进化距离最近的典型菌株生理生化指标的对比情况。菌株JSM 2175016与最接近的D.ficusCC-FR2-10T比较，呈革兰阴性反应，生长温度和对pH的耐受范围呈现差异，明胶水解能力较弱，脂酶和脲酶反应呈阴性。JSM 2215060与典型菌株D.daejeonensisMJ27T比较，对高温的耐受性要强，同时表现出典型菌株不具备的脲酶阳性反应。JSM 2215109和JSM 2155001与其系统发育关系最为密切的典型菌株比较，表现出典型菌株D.radiotoleransC1T所不具备的明胶水解和产脂酶的能力。

表3显示菌株JSM 2215105、JSM 2145010、JSM 2215108和JSM 2175012与典型菌株D.yunweiensisYIM 007T系统发育关系最为密切，在生理生化指标方面，与典型菌株D.yunweiensisYIM 007T相比而言，对温度的耐受范围窄，对pH的耐受范围广，革兰染色、过氧化氢酶、明胶水解、脂酶、脲酶等生理生化指标接近。

表2 JSM 2175016等4株异常球菌属菌株与该属相近菌株典型种特征比较

注:D.ficus、D.daejeonensis和D.radiotoleranss数据引自 Lai等[20]、Srinivasan等[18]和Ferreira等[21]；“+”表示阳性，“-”表示阴性，下表同

表3 JSM 2215105等4株异常球菌属菌株与该属相近菌株典型种特征比较

注：D.yunweiensis数据引自Zhangt等[18-19];W表示生长或反应很弱

3 讨论

我国传统白酒酿造主要依赖于环境中的微生物，长期的生产过程对酿酒环境微生物也进行了驯化，形成了独特的酿酒微生物区系[22]。馥郁香型酒鬼酒的制曲车间和酿造车间空气源中存在较高比例的淀粉酶活性和酯酶活性菌株[23-24]，同时还存在较高的类群多样性。在其他香型的白酒中，目前未见异常球菌属微生物的有效报道，本次分离出的8株异常球菌属微生物，拓展了酿酒微生物在分类学中的范畴。

对比了分离自馥郁香型酒厂空气源中异常球菌属微生物与各自分类地位接近的典型菌株的生理生化指标，考察结果显示分离自该酒厂的异常球菌属微生物表现出不同程度的明胶水解、脂酶和脲酶的特征，脂酶是传统发酵产品风味物质形成的物质基础[25-26]，现有报道这些生理特点主要以抗辐射特征为主的异常球菌，是否与馥郁香型酒鬼酒独特的风味物质形成有一定的相关性，还需进一步深入研究。

Biological Characteristic and Phylogenetic Analysis ofDeinococcusStrains Isolated from Fermentation Environment ofJiuguiLiquor

HE Jian-wu1, 2, LI You-you3, YANG Yu-ting1, FAN Lin2, LI Meng-Lin1, YU Bing3, YI Min1, LIU Zhu-xiang1, CHEN Yi-guang1

(1.Coll.ofBiol. &Environ′tSci.,JishouUni;2.Nat′l&LocalUnitedEngin.Lab.ofIntegrat.Utilizat′nTechnol.ofEucommiaulmoides; 3.JiuguiLiquorCo.Ltd.,Jishou416000)

Strain characteristics and phylogenetic analysis results of eightDeinococcusstrains isolated from air in fermentation and leaven making workshops ofJiuguiliquor offuxiangstyle using nutrition medium adding 10%Juiguiliquor mixed immersed juice and selecting and purifying phenotype similarDeinococcusstrains were reported in this paper. The results showed that 23 ambiguousDeinococcusstrains of were obtained through phenotype characteristics screening. Then, 8 out of 23 strains were investigated by means of phylogenetic analyses based on 16S rRNA gene sequence comparisons. The results suggested that, these 8 strains were the members of 4 species of the genusDeinococcus(D.radiotolerans,D.daejeonensis,D.ficus, andD.yunweiensis). Morphology and physiological and biochemical experiments show that the spores, gram staining, catalase, growth temperature range, pH range, polymer hydrolysis and other characteristics of theseDeinococcusstrains have different degree of imparities with the closest phylogenetic relations of the typical strains.

spirit;brewingenvironment;Deinococcus; airborne microbes; phylogenetic analysis