杨梅素对精氨酸激酶结构与功能的影响

褚 靖，汪劲松，张新潮，王卫东，潘继承

(湖北师范大学生命科学学院，湖北 黄石 435002)

杨梅素对精氨酸激酶结构与功能的影响

褚 靖，汪劲松，张新潮，王卫东，潘继承

(湖北师范大学生命科学学院，湖北 黄石 435002)

精氨酸激酶(arginine kinase，AK)是无脊椎动物能量代谢关键酶，杨梅素是一种黄酮类物质，具有多种生物活性。本文研究的是杨梅素对AK结构和功能的影响，采用AK活性分析、荧光光谱、圆二色光谱等技术研究杨梅素对精氨酸激酶结构与功能影响。研究结果表明：杨梅素可以有效地抑制AK活性，并导致AK二级结构和构象发生明显变化。为设计开发生物杀虫剂提供了理论依据。

杨梅素； AK ； 抑制剂 ； 结构； 功能

精氨酸激酶 (Arginine Kinase，AK) 是无脊椎动物体内参与细胞能量代谢的一种磷酸原激酶，是磷酸原激酶家族中的重要一员。 通过催化可逆性的反应

在ATP和精氨酸之间运输高能磷酸键，以此来调节细胞内ATP的水平[1-3]。反应产生的ADP可以作为合成ATP的前体物质，磷酸精氨酸可以作为合成ATP的高能磷酸键供体，通过这个可逆反应来维持体内ATP的稳态[4-6]。AK是节肢动物体内唯一的磷酸原激酶，在昆虫肌肉剧烈运动时，磷酸精氨酸是唯一能在合成ATP时提供磷酰基的供体。当昆虫剧烈运动时，可以提供大量能量，且能维持ATP的恒定水平[4，7-9]，当昆虫静止时，磷酸精氨酸又可以作为能量缓存库[10]。综上所述，AK是无脊椎动物能量代谢的关键性酶，它控制了无脊椎动物的整个生命活动的能量系统，维持无脊椎动物体内的能量动态平衡，AK的活性对无脊椎动物的生命活动至关重要。抑制AK的活性，能有效抑制无脊椎动物的能量代谢，使无脊椎动物的能量代谢过程发生紊乱，最终导致无脊椎动物的死亡。黄酮类物质是一种广泛分布在植物界的多酚类物质，是柑橘类水果和其他食物的主要成分，在许多国家作为健康饮食[10]。黄酮类物质具有多种生物学功能，包括抗癌症，防癌症，抗骨质疏松，降血脂，降血压，有益于心脑血管等功能。本文报道的是黄酮类物质杨梅素对精氨酸激酶结构与功能的影响，以期为开发新型生物杀虫剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

含有AK基因大肠杆菌Rosseta，由本实验室构建并保存；LB培养基( 1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0)；IPTG ( 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) 购自Sigma公司，琼脂糖亲和柱(Ni)购自Novagen公司，其它所用试剂均为国产分析纯。

1.2 实验仪器

Ultrospec 4300 pro型紫外分光光度计(Amersham bioscience)，荧光分光光度计F4500，圆二色光谱仪J-810，AKTA Purifier层析仪，高压灭菌锅(型号ZDX-35，上海申安医疗器械厂)

1.3 实验方法

AK的制备：取本实验室已构建成功的含有pET-21b-AK的E.coli BL21甘油菌20 μL接种于6 mL的LB试管培养基(已加入氨苄，工作浓度为100 μg/mL)，置于37 ℃摇床，恒温培养12 h；向大体积LB培养基中加入0.5%已活化好的菌液，置于37 ℃摇床，恒温培养2-3 h；扩大培养至菌液OD值在0.6～0.8之间时，向菌液中加入IPTG使其工作浓度为0.2 mM，置于20 ℃摇床，恒温培养12 h；将诱导后的菌液离心(5000 rmp，10 min)收集细胞沉淀，以蒸馏水洗沉淀一次；将细胞沉淀重悬于细胞裂解液中，于冰浴中超声破壁，于4 ℃，离心(12000 rpm，10 min)，取上清，即为粗蛋白提取液；采用His-tag/Ni亲和层析方法纯化，SDS-PAGE分析。

圆二色光谱分析：终浓度为22 μM的AK与不同浓度的黄酮类化合物混匀，于37 ℃恒温水浴30 min，测定圆二色光谱。

荧光光谱分析：终浓度为22 μM的AK与不同浓度的黄酮类化合物混匀，于37 ℃恒温水浴30 min，激发波长295 nm, 扫面波长范围300-400 nm, 测定其内源荧光。ANS荧光检测：向上述体系中各加入1～3 μL ANS(蛋白浓度约为ANS浓度的25倍)，避光反应30 min, 参数设定为激发波长380 nm, 扫描波长范围400～600 nm,测定ANS荧光光谱。

AK活性分析：将黄酮类化合物与AK混匀，置于30℃水浴10 min，参照文献[11]测定AK活性。

2 研究结果

2.1 AK活性分析

图1 黄酮类化合物与AK反应后测活曲线

由图1可以分析出杨梅素抑制AK活力的能力最强，其次是黄芩苷，槲皮素，山奈酚，小檗碱，而甘草酸二钾并没有表现出抑制AK活力的效果。

2.2 内源荧光图谱

图2 杨梅素与AK作用的内源荧光图

由图2可以看出，随着杨梅素浓度的增加，内源荧光强度下降，表明杨梅素导致AK色氨酸残基(Trp)微环境改变。

2.3 ANS荧光图谱

图3 不同浓度的杨梅素对AK的ANS荧光发射强度的影响

由图3可以看出，AK与不同浓度杨梅素反应之后，其外源荧光峰强逐渐减弱，并且呈浓度依耐性，随着杨梅素浓度的增加，峰强越来越小，这说明AK与杨梅素作用之后其表面的疏水性减弱。

2.4 圆二色光谱

图4 杨梅素AK与作用的圆二色光谱

由图4可以看到，加入杨梅素与AK作用之后，AK在215nm、222nm处的负椭圆度消失，AK的α螺旋、β折叠都有明显减少，表明杨梅素对AK的二级结构有明显影响。

3 讨论

上述研究结果表明，杨梅素、黄芩苷、槲皮素、山奈酚、小檗碱等化合物对精氨酸激酶都表现出不同程度的抑制能力，其中杨梅素展现出的抑制AK的能力最强，进一步的研究结果表明，2×10-4M杨梅素对AK活性的抑制率可以达到70%。圆二色和荧光光谱研究结果表明，杨梅素可以导致AK二级结构及其构象发生显著改变。上述研究结果为设计新型杀虫剂提供了一定的理论依据。

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(本文文献格式：褚 靖，汪劲松，张新潮，等.杨梅素对精氨酸激酶结构与功能的影响[J].山东化工，2017，46(04)：39-40，45.)

The Effects of Myricetin on Arginine Kinase's Structure and Function

ChuJing,WangJinsong,ZhangXinchao,WangWeidong,PanJicheng

(College of Life, Hubei Normal University, Huangshi 435002, China)

Arginine Kinase (AK) plays the key role in invertebrate energy metabolism. Myricetin is a kind of flavonoids compounds, with multiple biological activities. This paper focused on the effects of myricetin on AK's structure and function by the means of activity assay, fluorescence and circular dichroism spectrum. The research results indicated that myricetin could effectively inhibit AK's activity and cause the obvious conformation changes, which also provide important clues for rational designing and developing biological insecticide.

myricetin; arginine kinase; structure;function

2016-12-28

褚 靖(1990—), 湖北孝感人，硕士研究生,从事蛋白质结构与功能的研究；通信作者：潘继承，教授。

Q55

A

1008-021X(2017)04-0039-02