青藤碱对H2O2诱导人肝细胞损伤的保护作用研究

王效蕊 梁泰刚

（山西医科大学药学院，山西 太原 030001）

青藤碱对H2O2诱导人肝细胞损伤的保护作用研究

王效蕊 梁泰刚*

（山西医科大学药学院，山西 太原 030001）

目的研究青藤碱对H2O2诱导人肝细胞（HLO2）损伤的保护作用。方法以H2O2损伤HL02细胞建立氧化应激模型，MTT法检测细胞存活率；Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果青藤碱能明显改善H2O2诱导的细胞损伤，与模型组相比，青藤碱可提高细胞存活率，降低细胞的凋亡率。结论青藤碱对H2O2所致的HL02细胞损伤具有明显的保护作用。

青藤碱；H2O2；HL02；细胞损伤；凋亡

作为人体最主要的代谢器官，肝脏容易受到各种因素所导致的损伤，而肝损伤是导致肝硬化甚至肝癌的直接病因[1]。目前研究表明，氧化应激与肝损伤密切相关，氧化应激可以启动膜脂质过氧化，从而破坏肝细胞的功能和结构，最终导致细胞损伤和死亡[2]。近年来，人们发现一些天然活性物质能够通过降低氧化应激水平发挥肝保护作用[3]。

青藤碱（sinomenine）是从防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤茎中提取的一种生物碱单体。青藤碱生物活性很多，包括抗炎、抗心律失常、镇痛、降压、免疫抑制等多种药理作用，除此之外，青藤碱还具有清除氧自由基和抗氧化作用[4-5]。本文以H2O2刺激HL02细胞建立肝细胞氧化应激损伤模型，旨在研究青藤碱对体外肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：CO2培养箱（Heal Force HP90，上海力申科学仪器有限公司）；垂直层流超净台（Boxun，上海楚柏实验室设备有限公司）；流式细胞仪（BD-C6，USA）；Variskan Flash全波长多功能酶标仪（Thermo Scientific）。

1.1.2 细胞株：HL02细胞株购于中国科学院细胞库。

1.1.3 试剂：青藤碱（上海阿拉丁试剂有限公司，纯度＞97%）；含EDTA的胰酶、无EDTA的胰酶、青链霉素双抗混合液、1640培养基、胎牛血清（Invitrogen Life Technologies，Inc.，USA）；噻唑蓝（Sigma，USA）；双染凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养：HL02细胞置于含10%胎牛血清的1640培养基中，在5% CO2，37 ℃培养箱中培养，1～2 d换液1次，2～3 d传代1次，10代以内细胞用于下述实验。

1.2.2 H2O2诱导HL02细胞损伤模型的建立：加入终浓度为200、400、600 μmol/L H2O2，同时设阴性对照组，每组为4个复孔，继续培养6 h，检测细胞存活率[6]，确定H2O2最佳损伤作用浓度。

1.2.3 MTT实验：处于对数期生长的细胞用胰酶消化后，按5×104个/孔接种于96孔板中，培养24 h后，先加入不同浓度（5、10、20 μmol/L）青藤碱培养12 h，再加入终浓度为400 μmol/L H2O2共同培养6 h，检测细胞存活率。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 双染法：消化后的细胞，直接种于6孔板中，每孔1×105个/孔，细胞经青藤碱和H2O2处理后（按照MTT实验中的处理步骤），用无EDTA的胰酶消化收集细胞，PBS冲洗3遍，再重悬于200 μL binding buffer溶液中，每个样本加入5 μL Annexin V和5 μL PI，避光培养15 min，在1 h内上机检测[6]。

2 结 果

2.1 H2O2诱导HL02细胞损伤模型的建立：细胞活力检测结果表明H2O2可以浓度依赖性地损伤HL02细胞（表1），根据结果本研究选用H2O2400 μmol/L为最佳作用浓度。

2.2 青藤碱对H2O2诱导HL02细胞活力下降的影响：与阴性对照组相比较，模型组的细胞存活率下降为（56.31±2.43）%（P＜0.01），加入不同浓度的青藤碱保护后，细胞活力依次明显上升（表2）。

2.3 青藤碱对H2O2诱导HL02细胞凋亡的影响：见表2。H2O2培养细胞6 h细胞的凋亡率为（25.07±1.50）%，与阴性对照组相比具有明显的差异，加入不同浓度的青藤碱后，细胞凋亡率逐渐下降，并且具有剂量依赖性。

表1 H2O2对正常HL02细胞损伤的影响（）

表1 H2O2对正常HL02细胞损伤的影响（）

注：与阴性对照组相比，##P＜0.01

表2 青藤碱对H2O2诱导HL02细胞活力和凋亡率变化的影响（

表2 青藤碱对H2O2诱导HL02细胞活力和凋亡率变化的影响（

注：与阴性对照组相比，##P＜0.01，与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

青藤碱浓度(μmol/L) 细胞存活率(%) 总凋亡率(%)阴性对照组 - 100 4.63±3.10 56.31±2.43## 25.07±1.50##5 64.44±1.56* 20.05±1.92* 10 74.90±4.19** 14.16±2.26** 20 83.84±3.74** 12.74±0.65** 0 H2O2处理组

3 讨 论

氧化应激是细胞内的抗氧化系统和氧化系统失衡造成细胞氧化损伤的一种现象。肝细胞的氧化损伤是酒精性肝病、自身免疫性肝疾病、慢性毒性肝炎、肝硬化甚至肝癌等多种肝性疾病的共同特征，与肝组织坏死、细胞凋亡、肝功能下降密切相关[7-8]。

本实验以H2O2损伤HL02细胞为损伤模型，研究青藤碱对H2O2损伤细胞的保护作用。细胞活力测定实验表明青藤碱可以浓度依赖性地抑制H2O2诱导细胞活力的下降。流式双染法是经典的测定细胞凋亡率的方法，结果表明青藤碱可以减少H2O2诱导的细胞凋亡率的升高。初步认为青藤碱可以保护H2O2诱导的HL02细胞损伤。本实验结果提示青藤碱可用于预防肝性疾病的发生，其具体作用机制有待进一步研究。

[1] 覃慧敏,田卫群.骨髓间充质干细胞经不同移植途径治疗终末期肝病[J].中华临床医师杂志,2011,5(21):6416-6418.

[2] 张剑平,魏红山,孙静媛,等.脂质过氧化在乙型肝炎后肝硬化,急性乙型肝炎,重型乙型肝炎的损伤作用[J].世界华人消化杂志, 2005,13(12):1465-1466.

[3] 王忠雷,杨丽燕,张小华,等.天然产物抗氧化活性成分研究进展[J].药物评价研究,2012,35(5):386-389.

[4] 朱士龙,陈迪钊,李勇,等.青藤碱的最新研究进展[J].吉首大学学报(自然科学版),2011,32(5):95-100.

[5] 刘刚,王辉,张先洲,等.青藤碱清除氧自由基和抗脂质过氧化作用[J].中草药,2006,31(1):84-87.

[6] 宋颖,李尘远,张孟姝,等.银杏内酯B对谷氨酸诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用[J].中药药理与临床,2015,31(5):23-27.

[7] 顾伟,范昕建,吴疆,等.胡黄连苷Ⅱ对H2O2损伤L-02细胞的保护作用[J].世界华人消化杂志,2008,16(29):3274-3278.

[8] 嵇月峨,施文艳,杨俭.牛磺酸对大鼠心肌缺血再灌注后肝损伤的保护作用[J].中国医药指南,2012,11(34):69-70.

R575

B

1671-8194（2017）19-0052-02

山西省2014年高校优秀青年学术带头人才项目资助；国家自然基金（NO81101687）资助

*通讯作者：E-mail:ltaigang@163.com