CXCR4抑制剂AMD3465调节肺癌细胞株增殖、侵袭的实验研究

2017-09-03梁涛王彬汪涛柳曦李捷

中华肺部疾病杂志(电子版) 2017年4期

梁涛王彬汪涛柳曦李捷

·论著·

梁涛1，2王彬1汪涛1柳曦1李捷1

目的探讨CXCR4抑制剂AMD3465对肺癌细胞株增殖、侵袭的影响。方法培养肺癌细胞株A549并分为AMD3465组、对照组；分别用含有三种不同剂量(50 、100、200 mg/L)AMD3465的DMEM处理以及用不含药物的DMEM处理。处理后12、24、48 h，检测细胞的增殖活力和侵袭数目；处理后48 h，检测细胞中增殖及侵袭基因的mRNA表达量。结果处理后12、24、48 h，三种不同剂量(50、100、200 mg/L)AMD3465组细胞的OD值均显著低于对照组、侵袭数目均显著少于对照组，AMD3456剂量较低时OD值、侵袭数目与对照组差距均大于AMD3456剂量较高时(P<0.05)；处理后48 h，50 mg/L AMD3465组、100 mg/L AMD3465组、200 mg/L AMD3465组细胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67、CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表达量均显著低于对照组；AMD3456剂量较低时细胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67、CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表达量与对照组差距均大于AMD3456剂量较高时(P<0.05)。结论CXCR4抑制剂AMD3465能够有效抑制肺癌细胞株的增殖、侵袭。

支气管肺癌； CXC受体4；增殖；侵袭

肺癌是全球范围内发病率最高的恶性肿瘤，全球每年肺癌所致死亡的人数超过140万，肺癌细胞的增殖、侵袭是影响肺癌预后及病情转归的重要生物学行为[1-3]。但关于肺癌细胞增殖、侵袭的调控机制尚未完全阐明。基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是重要的趋化因子，与多种细胞的迁移、侵袭密切相关。近年来关于肺癌增殖和侵袭的研究认为，SDF-1及其受体CXCR4在肺癌细胞恶性生物学行为的调控中发挥关键作用，肺癌组织中CXCL12及CXCR4均呈高表达的趋势[4-5]。但是，目前关于CXCR4是否直接参与肺癌细胞增殖、侵袭的调控尚未明确。ADM3465是CXCR4的特异性抑制剂，能够选择性地抑制CXCR4所介导的生物学效应。为了明确CXCR4对肺癌细胞增殖、侵袭的调控作用，本研究具体分析了CXCR4抑制剂AMD3465对肺癌细胞株增殖、侵袭的影响。

材料与方法

一、实验材料

A549肺癌细胞株来自解放军总医院分子生物实验室，细胞培养基、胎牛血清及胰蛋白酶均购于Gibco公司，RNA抽提试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购于北京康为世纪公司，PCR引物由上海生工公司设计并合成，CXCR4抑制剂AMD3465由解放军总医院核医学科合成。

二、实验方法

1. 细胞培养及处理方法: A549细胞株用含有10%胎牛血清的DMEM培养，细胞密度生长至90%后用0.125%的胰蛋白酶常规消化，消化后的细胞传代扩增并接种在培养板中。培养板中的细胞密度生长至90%后进行处理，对照组用不含药物的DMEM处理，50 mg/L AMD3465组、100 mg/L AMD3465组、200 mg/L AMD3465组分别用含有50mg/L AMD3465的DMEM、含有100 mg/L AMD3465的DMEM、含有200 mg/L AMD3465的DMEM处理。

2. 细胞增殖活力的检测方法: 用于细胞增殖活力的细胞接种在96孔培养板中，每孔加入200 μl细胞悬液、密度为5×104/ml，处理后12、24、48 h，向培养体系中直接加入MTS试剂盒中的检测液，20 μl/孔，继续孵育3～4 h后检测各培养孔内细胞在570 nm波长处的吸光度(OD值)。

3. 细胞侵袭的检测方法: 将BD公司的BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber取出并在室温放置，在上层小室和下层小室内加入预热到37 ℃的DMEM，使基质水化后向上层小室内加入消化所得细胞悬液、每孔加入500 μl细胞悬液、密度为5×104/ml，下层小室中加入500 μl含有1%胎牛血清的DMEM。不同条件处理12、24、48 h，切下上层小室的微孔膜，5%结晶紫染色后PBS洗涤2遍，最后在高倍视野下观察细胞数目。

4. 基因mRNA表达量的检测方法: 用于基因mRNA表达量检测的细胞接种在6孔培养板中，每孔加入1.5 ml细胞悬液、密度为5×104/ml，处理后48 h，采用RNA抽提试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒分离细胞中的总RNA并反转录为cDNA；采用荧光定量PCR试剂盒扩增CyclinD1、PCNA、Ki-67、CatB、MMP2、MMP9、MMP13，根据扩增曲线计算基因的mRNA表达量。

三、统计学方法

采用SPSS20.0软件录入数据并进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为有统计学意义。

结果

一、两组细胞的增殖活力比较

处理后12、24、48 h，50 mg/L AMD3465组、100 mg/L AMD3465组、200 mg/L AMD3465组细胞的OD值均显著低于对照组；AMD3456剂量较低组OD值与对照组OD值的差距，大于AMD3456剂量较高组OD值与对照组OD值的差距(P<0.05)，见表1。

表1 两组细胞的增殖活力比较

注:a：与对照组比较，P<0.05；b：与50 mg/L AMD3465组比较，P<0.05；c：与100 mg/L AMD3465组比较，P<0.05

二、两组细胞的侵袭能力对比

处理后12、24、48 h，50 mg/L AMD3465组、100 mg/L AMD3465组、200 mg/L AMD3465组细胞的侵袭数目均显著少于对照组，AMD3456剂量较低组侵袭数目与对照组侵袭数目的差距，大于AMD3456剂量较高组侵袭数目与对照组侵袭数目的差距(P<0.05)，见表2。

表2 两组细胞的侵袭能力比较

注：a：与对照组比较，P<0.05；b：与50 mg/L AMD3465组比较，P<0.05；c：与100 mg/L AMD3465组比较，P<0.05

三、两组细胞中增殖基因的表达差异

处理后48 h，50 mg/L AMD3465组、100 mg/L AMD3465组、200 mg/L AMD3465组细胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67的mRNA表达量均显著低于对照组；AMD3456剂量较低组细胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表达量与对照组细胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表达量的差距，大于AMD3456剂量较高组细胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表达量与对照组细胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表达量的差距(P<0.05)，见表3。

表3 两组细胞中增殖基因的表达量比较

注：a：与对照组比较，P<0.05；b：与50 mg/L AMD3465组比较，P<0.05；c：与100 mg/L AMD3465组比较，P<0.05

四、两组细胞中侵袭基因的表达差异

处理后48 h，50 mg/L AMD3465组、100 mg/L AMD3465组、200 mg/L AMD3465组细胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表达量均显著低于对照组，AMD3456剂量较低组细胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表达量与对照组细胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表达量的差距，大于AMD3456剂量较高组细胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表达量与对照组细胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表达量的差距(P<0.05)，见表4。

讨论

SDF-1是哺乳动物体内重要的趋化因子，与受体CXCR4结合后能够通过激活下游多种信号通路来调控细胞的生长、运动、粘附等过程。近年来，SDF-1/CXCR4信号通路与恶性肿瘤的关系受到了越来越多的关注，该信号通路能够指示肿瘤细胞沿着CXCL12的浓度梯度进行迁移和运动，进而向邻近组织或远处组织中SDF-1高表达的区域浸润[6-8]。已有研究报道，肺癌组织中CXCR4和SDF-1呈高表达的趋势[9]，但关于SDF-1/CXCR4信号通路对肺癌细胞生长和运动的影响尚未明确。为了明确SDF-1/CXCR4通路对肺癌细胞恶性生物学行为的影响，本研究采用CXCR4的抑制剂AMD3465来选择性抑制CXCR4的生物学效应，进而对细胞的增殖活力和侵袭数目进行分析，结果显示：不同剂量AMD3465组细胞处理后12、24、48 h的OD值均显著低于对照组、侵袭数目均显著少于对照组。这就说明CXCR4抑制剂AMD3465对肺癌细胞株的增殖、侵袭具有抑制作用，也提示SDF-1/CXCR4通路参与了肺癌增殖和侵袭的调控。

在肺癌细胞的增殖过程中，细胞周期进程的加速是促进细胞增殖的重要环节，而细胞周期的进程又与多种基因的表达变化密切相关。CyclinD1是调节细胞周期进程的关键蛋白，与CDK4和CDK6结合所形成的CyclinD1-CDK4/6复合物能够引起Rb蛋白发生磷酸化并释放转录因子E2F，进而驱动细胞周期由G1期进入S期和G2期、促进细胞的增殖[10-11]。PCNA是参与DNA复制及核酸剪切过程的辅助分子，还能与CyclinD1相互作用并加速细胞周期的进程；Ki-67是细胞周期进程的标志分子之一，在细胞周期的G1期开始逐步出现、在S期和G2期达到高峰，而在G0期则几乎不表达。本研究通过分析CXCR4的抑制剂AMD3465对肺癌细胞中上述增殖基因表达量的影响显示：不同剂量AMD3465组细胞中处理后48 h CyclinD1、PCNA、Ki-67的mRNA表达量均显著低于对照组。这就说明CXCR4抑制剂AMD3465对肺癌细胞中增殖基因的表达量具有负性调节作用，也提示SDF-1/CXCR4通路参与了肺癌中增殖基因表达的调控。

表4 两组细胞中侵袭基因的表达量比较

注：a：与对照组比较，P<0.05；b：与50 mg/L AMD3465组比较，P<0.05；c：与100 mg/L AMD3465组比较，P<0.05

SDF-1/CXCR4通路对细胞的黏附、迁移和运动具有调节作用，而肺癌细胞的局部浸润和远处转移不仅依赖于细胞的黏附、迁移，同时还与细胞外基质及基底膜的降解密切相关。蛋白酶是水解细胞外基质及基底膜中多种成分的重要催化酶，能够促进细胞突破细胞外基质及基底膜的限制并向临近组织浸润和远处组织转移。CatB、MMP2、MMP9、MMP13等蛋白酶是与肺癌细胞侵袭密切相关的蛋白酶，CatB是细胞溶酶体的组成部分，能够有效激活纤溶酶原激活剂并促进细胞外基质的降解[12-14]；MMP2、MMP9、MMP13是MMPs家族的重要成员，对细胞外基质及基底膜中的Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、弹性蛋白等成分具有直接的水解作用，能够促进细胞外基质及基底膜的降解[15-16]。本研究通过分析CXCR4的抑制剂AMD3465对肺癌细胞中上述侵袭基因表达量的影响显示：不同剂量AMD3465组细胞中处理后48 h CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表达量均显著低于对照组。这就说明CXCR4抑制剂AMD3465对肺癌细胞中侵袭基因的表达量具有负性调节作用，也提示SDF-1/CXCR4通路参与了肺癌中侵袭基因表达的调控。

综上所述，SDF-1/CXCR4通路参与了肺癌增殖、侵袭的调控；CXCR4抑制剂AMD3465能够有效抑制肺癌细胞株的增殖、侵袭。

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(本文编辑：王亚南)

梁涛，王彬，汪涛，等. CXCR4抑制剂AMD3465调节肺癌细胞株增殖、侵袭的实验研究[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版)， 2017， 10(4)： 398-401.

Experimental study of CXCR4 inhibitor AMD3465 regulating proliferation and invasion of lung carcinoma cell line

LiangTao1,2,WangBin1,WangTao1,LiuXi1,LiJie1.

1DepartmentofThoracicSurgery,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853,China;2DepartmentofThoracicSurgery,GeneralHospitalofRocketArmy,PLA,Beijing100853,China

Correspondingauthor：LiJie,Email：13801010576@163.com

Objective To study the effect of CXCR4 inhibitor AMD3465 on proliferation and invasion of lung carcinoma cell lines. Methods The lung carcinoma cell line A549 was cultured and divided into 50 mg/L AMD3465 group, 100 mg/L AMD3465 group, 200 mg/L AMD3465 group treated with DMEM containing different dosage of AMD3465 and control group treated DMEM without drug. After 12 h, 24 h and 48 h, the proliferation and invasion number of the cells were detected. After 12 h, the mRNA expression of cell proliferation and invasion genes were detected. Results 12 h, 24 h, 48 h after treatment, OD values of 50 mg/L AMD3465 group, 100 mg/L AMD3465 group, 200 mg/L AMD3465 group were significantly lower than the control group, invasion number were significantly less than the control group，the differences of OD values and invasion number between control group and lower dosage ADM3456 group were larger than higher dosage AMD3465(P<0.05); 48 hours after treatment, mRNA expression of CyclinD1, PCNA, Ki-67 cells, CatB, MMP2, MMP9, MMP13 of 50mg/L AMD3465 group, 100 mg/L AMD3465 group, 200 mg/L AMD3465 group were significantly lower than the control group; the differences of mRNA expression of CyclinD1, PCNA, Ki-67 cells, CatB, MMP2, MMP9, MMP13 between control group and lower dosage ADM3456 group were larger than higher dosage AMD3465(P<0.05). Conclusion CXCR4 inhibitor AMD3465 can effectively inhibit the proliferation and invasion of lung carcinoma cell lines.

Bronchogenic carcinoma; CXC receptor 4; Proliferation; Invasion

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.04.004

国家自然科学基金资助项目(81573026)

100853 北京，中国人民解放军总医院胸外科1100088 北京，中国人民解放军火箭军总医院胸外科2

李捷， Email：13801010576@163.com

R563

2017-06-04)