猪场水源水及管网水肠球菌耐药特性差异研究

林云琴,曾中华,陈如登

(1.福建省福清市畜牧兽医中心,福建 福清 350100;2.福建省漳州市动物疫病预防控制中心,福建 漳州 363000; 3.福建省农产品质量安全检验检测中心,福建 福州 350000)

猪场水源水及管网水肠球菌耐药特性差异研究

林云琴1,曾中华2,陈如登3

(1.福建省福清市畜牧兽医中心,福建 福清 350100;2.福建省漳州市动物疫病预防控制中心,福建 漳州 363000; 3.福建省农产品质量安全检验检测中心,福建 福州 350000)

从福州地区9个猪场不同来源的饮用水中分离获得42株肠球菌。采用微量肉汤稀释法对这些分离菌进行药物敏感性实验,测定了它们对6种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。结果表明：这些分离菌对土霉素、红霉素、氯霉素、环丙沙星、氨苄西林和万古霉素的耐药率分别为80.95%、66.67%、35.71%、19.05%、16.67%、14.29%；水池进水口及蓄水池分离菌对土霉素和红霉素的耐药率略低于饮水器饮用水分离菌的，但对氯霉素、环丙沙星、氨苄西林的耐药率均显著低于饮水器分离菌的;保育舍饮水器分离菌对所有抗生素都有更高的耐药率；所分离的肠球菌共有11种耐药谱,发现有11株分离菌对4～5种抗生素耐药,其中5株来自保育舍饮水器；水池进水口及蓄水池分离菌的多重耐药率均低于饮水器分离菌的,以保育舍饮水器分离菌的多重耐药率最高。

猪场;饮用水;肠球菌;抗生素；耐药性;饮水管网

目前细菌耐药问题引起了人们的普遍关注,已经开展大量研究对病原微生物的耐药现状进行监控[1-4],同时对其耐药基因(ARGs)进行密集监测[5-7],了解其可能的传播途径。肠球菌是人类及畜禽肠道常见菌群之一,是粪便污染指示菌之一。肠球菌的来源相当广泛,存在于人类生活污水、动物粪便以及无脊椎动物、植物、土壤等环境中[8]。近年来的研究表明,粪肠球菌和屎肠球菌越来越成为条件致病菌,是医院内感染的重要致病菌,其在致病性革兰氏阳性球菌中的地位仅次于葡萄球菌。

开展养殖场环境中细菌耐药性研究具有特别重要的意义。目前国内外关于养殖场细菌耐药方面的研究,大多是对养殖场粪便、废水、沼气池以及周边水环境的研究[9-10],而对畜禽饮用水管网中的细菌耐药性研究目前鲜见报道。国内养猪场饮水管网很少得到清洗,又经常进行饮水给药的操作,使饮水管网中富集大量的耐药细菌,从而可能对饮水品质产生影响。

我们探讨了猪场饮用水中细菌在经过饮水管网前后的耐药特性的变化,了解猪场饮用水中肠球菌的耐药及分布情况,明确饮水管网对饮用水中肠球菌耐药的影响,旨在为猪场饮用水细菌耐药性研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基及PCR试剂 本实验所用的培养基主要有:胰蛋白大豆营养琼脂(OXOID CM0131)、肠球菌选择培养基(OXOID CM0377)、M-H肉汤。PCR反应所需试剂主要购自鼎国生物和上海生工。

1.1.2 质控标准菌 粪肠球菌(ATCC29212),购自中国药品生物制品检验所。

1.1.3 抗生素标准品 所用6种抗生素标准品均购自中国药品生物制品检验所。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 采集了福州地区9个猪场饮用水的45份水样;猪场内的采样点主要包括水源进水口、蓄水池、怀孕舍饮水、分娩舍饮水、保育舍饮水及肥育舍饮水。每个采样点收集2份平行水样,用聚乙烯瓶密封,且每个采样点采集水样不小于1.0 L。采集的水样尽量避免阳光照射,于4 ℃条件下保存,尽快送至实验室,在24 h内处理完成。

具体采样方法:(1)可以直接用聚乙烯瓶接水的采样点:在接水前,先将饮水器打开，放去前段水10～20 s；然后用饮水器的流水将聚乙烯瓶润洗两遍；最后直接将聚乙烯瓶对准水流,隔空接水。(2)较难接触到且不能直接用聚乙烯瓶采样的点:用自制的水样采集器直接浸入0.3～0.5 m处取水,然后将样品注入聚乙烯瓶中,采样时不应采到表面水；应将采样器瓶口朝下浸入水中,将瓶倾斜,使瓶口微微向上，注意不能混入漂浮于水面上的物质；在采集完后,要对水样进行标记,及时登记水样信息表。

1.2.2 水样的处理 用SHZ-Ⅲ型循环水真空泵将各点采集的水样用0.22 μm滤膜过滤富集细菌,每次过滤水样体积为300 mL。然后将滤膜放入2 mL MH灭菌肉汤中,并放置于摇床(37 ℃、190 r/min)增菌培养6 h。

1.2.3 肠球菌的分离纯化 将增菌培养后的液体划线接种于肠球菌选择培养基,放置于恒温(37 ℃)培养箱中培养24～48 h。可见培养基上长出红色或粉红色的圆形、润滑菌落。然后挑取典型单菌落，将其接种于胰蛋白大豆营养琼脂上增菌,在37 ℃下培养18～24 h。

1.2.4 肠球菌的鉴定

1.2.4.1 肠球菌的生化鉴定 取在胰蛋白大豆营养琼脂上长出的单个白色圆形菌落,分别接种于pH 9.6的MH肉汤、含6.5%NaCl的MH肉汤、0.1%美蓝牛奶中,于37 ℃恒温培养18～24 h；另取菌落接种于高压灭菌过的2 mL MH肉汤中，于摇床(37 ℃、191 r/min)培养6 h,观察细菌生长情况，做初步判断,待检。

1.2.4.2 肠球菌的PCR鉴定 (1)水煮法提取细菌DNA:采用水煮法提取生化鉴定中合格的细菌DNA。首先,用接种环挑取解冻菌液，接种于装有2 mL灭菌MH肉汤的试管中,于37 ℃培养18～24 h；再将试管中的菌液全部转移到2 mL无菌离心管中,以12000 r/min离心2 min,弃去上清液；然后,往离心管中加入200 μL灭菌双蒸水,沸水浴10 min,接着冰浴3 min；最后以8000 r/min离心5 min,取上清液,置于-20 ℃保存备用[11]。

(2)PCR反应:采用PCR法对分离纯化得到的肠球菌进行肠球菌属鉴定。以每个样本不超过1株分离菌为原则。针对肠球菌属的高度保守的tuf基因组片段设计特异性引物(Ent1、Ent2)来鉴定分离株的属类，其中上游引物Ent1为5′-TACTGACAAACCATTCATGATG-3′，下游引物Ent2为5′-AATTCGTCACCAACGCGAAC-3′。目的扩增片段长度为112 bp,反应体系如表1所示。PCR反应条件:先在95 ℃下预变性3 min；然后在94 ℃下变性30 s,65 ℃退火45 s,72 ℃ 30 s,共30个循环；最后在72 ℃下延伸10 min。在电泳结束后,取出凝胶置于凝胶成像系统获取图像并保存,电泳的结果以500 bp的Maker为参照,将PCR产物出现目的亮带112 bp的样本菌株鉴定为肠球菌。

表1 PCR反应扩增体系

1.2.5 肠球菌的保存 将通过PCR方法鉴定为肠球菌属的菌株接种于灭菌的2 mL MH肉汤中,置于摇床(37 ℃、190 r/min)培养6 h,在菌液中加入20%的甘油。每株菌保存两份,分别放置于-20 ℃和-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.6 肠球菌药敏实验

1.2.6.1 微量肉汤稀释法 采用微量肉汤稀释法测定样本肠球菌对6种抗生素的最小抑菌浓度(即MIC值)，严格根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的方法进行操作。

1.2.6.2 接种菌液的配制 把保存的实验样本菌株的甘油菌解冻,取20 μL甘油菌液于装有2 mL灭菌MH肉汤的EP管中,放置于摇床(37 ℃、191 r/min)培养6 h。用紫外分光光度计测定上述菌液的OD600值。然后用MH肉汤稀释菌液将其浓度调整到吸光度为0.08～0.10之间,即为0.5麦氏比浊[(1～2)×108CFU/mL]；在接种时再稀释10倍,此时菌液浓度为107CFU/mL。

1.2.6.3 抗生素储备液的配制 将抗生素制备成浓度为5120 μg/mL的储存液；在使用前先用0.22 μm的灭菌滤膜除去细菌,再稀释成各种所需要的浓度。抗生素储存液的配制方法见表2。

1.2.6.4 药敏实验操作过程 药敏实验使用的是具盖96孔U型板。首先,在96孔U型板上加入100 μL灭菌MH肉汤。其次,将抗生素储存液稀释10倍,在板上将其倍比稀释成所需的11个浓度,分别是256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL；第12孔不加抗生素,设置为阴性或阳性对照孔。最后,在铺好肉汤和抗生素的孔上加入10 μL浓度为107CFU/mL的菌液。将96孔U型板置于37 ℃恒温箱培养18～24 h，然后观察结果。每块板的操作时间控制在15 min以内。

表2 各种抗生素储存液的配制方案

1.2.6.5 药敏实验结果判定 在读取所测试菌株的MIC值前,首先观察每块板的对照孔细菌生长情况是否良好,同时还须检查接种物的传代培养情况以确定其是否受到污染以及质控菌株的MIC值是否在质控范围内。MIC值即为肉眼观察微量稀释孔中的细菌生长完全被抑制时的最低抗菌药物浓度。根据CLSI提供的判定标准(表3)来判定样本菌对抗生素的耐药程度。

表3 肠球菌稀释法药敏实验解释标准

1.2.6.6 统计学处理 采用Excel软件统计处理肠球菌的药敏实验数据。

1.2.6.7 抗生素耐药谱分析 本实验分别以A、C、H、O、V、E代表氨苄西林、环丙沙星、氯霉素、土霉素、万古霉素和红霉素,用来表示分离菌对6种抗生素的耐药谱情况,如:ACH谱型表示对氨苄西林、环丙沙星和氯霉素同时耐药。

1.2.6.8 肠球菌多重耐药情况分析 分别以1耐、2耐、3耐、4耐表示分离菌同时对1、2、3、4种抗生素耐药；中介表示至少对1种抗生素不敏感；敏感则表示对6种抗生素都敏感。

2 结果与分析

2.1 肠球菌分离与鉴定结果

本实验共采集了福州地区9个猪场的42株肠球菌。PCR鉴定的凝胶琼脂电泳结果见图1。

2.2 福州地区猪场饮用水肠球菌的药敏实验结果

从福州地区9个猪场饮用水中共分离得到42株肠球菌,这些分离菌对6种抗生素的耐药情况见表4。

图1 PCR鉴定的凝胶琼脂电泳图

总体上,分离菌对抗生素的耐药情况表现为土霉素>红霉素>氯霉素>环丙沙星>氨苄西林>万古霉素,耐药率分别为80.95%、66.67%、35.71%、19.05%、16.67%、14.29%。可见,分离菌对土霉素和红霉素的耐药率居前2位；对万古霉素的耐药率最低,耐药率为14.29%。

表4 福州地区猪场饮用水肠球菌对6种抗生素的药敏实验结果 %

注:“R”表示耐药;“I”表示中介;“S”表示敏感;各采样点药敏比率表示在每个采样点内,分离菌的药敏表型占对应采样点分离菌数的比率;总药敏比率指所有采样点分离菌的药敏表型占所有分离菌(42株)的比率。

从不同采样点的耐药情况来看:(1)水池进水口分离菌对抗生素的耐药情况:土霉素>红霉素>万古霉素>氯霉素>环丙沙星=氨苄西林,耐药率分别为77.78%、55.56%、33.33%、22.22%、11.11%、11.11%;分离出3株VRE;(2)蓄水池分离菌对抗生素的耐药情况:土霉素>红霉素>氯霉素>万古霉素=氨苄西林,耐药率分别为87.50%、50.00%、25.00%、12.50%、12.50%,没有检测到耐环丙沙星的肠球菌;分离出1株VRE;(3)保育舍饮水分离菌对抗生素的耐药情况:土霉素=红霉素>氯霉素>氨苄西林=环丙沙星,耐药率分别为77.78%、77.78%、66.67%、44.44%、44.44%,没有分离出VRE;(4)育肥舍饮水分离菌对抗生素的耐药情况:土霉素=红霉素>氯霉素>环丙沙星>万古霉素,耐药率分别为75.00%、75.00%、37.50%、25.00%、12.50%,没有分离到耐氨苄西林的肠球菌;分离出1株VRE;(5)母猪舍饮水分离菌对抗生素的耐药情况:土霉素>红霉素>氯霉素>氨苄西林=环丙沙星=万古霉素,耐药率分别为87.50%、75.00%、25.00%、12.50%、12.50%、12.50%;分离出1株VRE。

2.3 福州地区猪场饮水肠球菌对6种抗生素的耐药谱

由表5可知,福州地区9个猪场饮水肠球菌有11种耐药谱,进水口、水池、保育舍饮水、育肥舍饮水、分娩舍饮水肠球菌的耐药谱类型分别有5、4、6、6、5种；总体上,耐药谱以HOE、OE、O为主,分别占分离菌总数(42株)的16.67%、14.29%、14.29%。发现有11株分离菌对4～5种抗生素耐药,耐药谱为AHOVE、AOVE、ACOE、CHOE,其中有5株是由保育舍饮水得到的。

2.4 福州地区猪场饮用水肠球菌的多重耐药情况

由图2可知,福州地区9个猪场饮水分离肠球菌具有1～5重耐药的情况均有出现,具体如下:(1)进水口分离菌存在1、3、4重耐药,以3重耐药为主,没有敏感菌和2重耐药菌,2重以上的耐药率为66.66%;(2)水池分离菌存在1、2、3、5重耐药,以1耐、2耐为主,有敏感菌,没有中介、4耐菌,2重以上的耐药率为50.00%;(3)保育舍饮水分离菌1～5重耐药均有存在,以3、4、5重耐药为主,没有敏感菌、中介菌,2重以上的耐药率为88.89%;(4)育肥舍饮水分离菌存在2、3、4重耐药,以3重耐药为主,没有敏感菌、5耐菌,2重以上的耐药率为75.00%;(5)分娩舍饮水分离菌存在2、3、4重耐药,以2、4重为主,没有敏感菌、5耐菌,2重以上的耐药率为75.00%。

表5 福州地区猪场饮用水肠球菌的耐药谱

注:“/”表示采样点分离菌没有对应的耐药谱;“比率”指具有相同耐药谱的分离菌株数占所有分离菌(42株)的比率。

图2 福州地区猪场饮用水肠球菌的多重耐药情况

3 讨论

在本实验中，猪场饮用水分离菌主要对土霉素、红霉素、氯霉素、环丙沙星的耐药率较高。这与卓鸿璘[8]于2007年对3个猪场的不同年龄段的猪只肛门采样以及猪场环境的粪肠球菌的耐药情况调查结果一致。四环素类和大环内酯类的药物在猪场常常用于预防和治疗猪的疾病,还经常将其作为饲料添加剂使用。本实验结果表明,猪场饮用水的分离菌对土霉素和红霉素的耐药情况较严重,今后在临床上应尽量少用或不用。氯霉素早已被禁止用作饲料添加剂,但是分离菌对其表现出较高的耐药率,这可能与氯霉素类抗菌素氟苯尼考在猪场的广泛使用有关。

观察每个猪场的5个采水点分离菌的耐药情况,总体上有两种现象:一是,水源或水池的分离菌对抗生素敏感或者只耐1种抗生素(土霉素或红霉素),但是保育舍、分娩舍、育肥舍饮水中的分离菌几乎都表现出多重耐药;二是,水池或水源、保育舍、怀孕舍、分娩舍、育肥舍的饮水分离菌都表现为多重耐药。第一种现象可能是因为猪场的水源并没有耐药菌或多重耐药菌,或者水池得到了定期清洗,但是猪场饮水给药的方式导致耐药菌会在蓄水池之后的管道里残留并繁殖。第二种现象可能是因为水源已经存在耐药菌,或者水池不常清洗,导致耐药菌大量增加,进而导致输水管道也有耐药菌繁殖增长。

养殖场抗生素的给药方式主要有饲料添加、饮水添加及肌肉注射三种,其中饮水及饲料添加等低浓度给药方式已被证明是最容易导致细菌产生耐药性的给药方式。因此本研究重点考察猪场水源饮用水以及饮水器饮用水耐药肠球菌的差异,我们发现福建省猪场目前水源饮用水耐药率明显低于饮水器饮用水,表明该省猪场目前的饮水管网普遍存在耐药细菌污染的情况,应该引起高度关注。据了解,目前国外养殖场普遍有对饮水管网进行清洗的习惯,清洗频率通常为每个月一次。而国内养猪场几乎没有清洗管网的习惯,长期未清洗的管网容易形成生物膜,而生物膜耐药是细菌耐药的重要机制之一；加上有些管网比如保育舍的饮用水管网经常添加抗生素和抗应激剂等产品,致使其中的耐药细菌更容易被诱导和选择出来,因此,本实验中的猪场饮水器饮用水普遍存在高比率的耐药肠球菌,其中保育舍饮水器肠球菌耐药水平最高。以上结果提醒我们对国内猪场饮水器进行定期清洗的重要性和迫切性。

本实验发现,某些猪场源头饮用水就存在肠球菌耐药严重的现象,提示这些猪场的源头饮用水存在被地表水污染的可能。在美国,有专家提出可以用水中细菌耐药的模式ARP来指示水体污染的来源；建议以上猪场的管理者寻找污染的来源,并及时改进。在本实验中我们还发现普遍存在水源进水口的肠球菌耐药情况比蓄水池要好的现象,这可能与国内猪场普遍忽视蓄水池的管理和清洗有关；同时,有些猪场在蓄水池中使用消毒剂,可能也是选择出更多耐药菌的原因。

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(责任编辑:黄荣华)

Difference Study on Antibiotic-resistant Characters ofEnterococcusfrom Original Water and Pipe-network Water of Pig Farms

LIN Yun-qin1, ZENG Zhong-hua2, CHEN Ru-deng3

(1. Animal Husbandry and Veterinary Center of Fuqing City in Fujian Province, Fuqing 350100, China; 2. Animal Disease Prevention and Control Center of Zhangzhou City in Fujian Province, Zhangzhou 363000, China; 3. Agricultural Product Quality and Safety Inspection and Testing Center of Fujian Province, Fuzhou 350000, China)

A total of 42Enterococcusstrains were isolated from the original water and pipe-network water of 9 pig farms in Fuzhou area, and the minimal inhibitory concentrations (MIC) of these strains to 6 kinds of antibiotics were detected by using micro-broth dilution method. The research results showed that the resistant rate of 42 strains to oxytetracycline, erythrocin, chloromycetin, ciprofloxacin, ampicillin and vancomycin was 80.95%, 66.67%, 35.71%, 19.05%, 16.67% and 14.29%, respectively. The isolates from water inlet of pool and impounding reservoir had a slightly lower resistant rate to oxytetracycline and erythrocin than those from drinking bowl, while they had a significantly lower resistant rate to chloromycetin, ciprofloxacin and ampicillin than those from drinking bowl. The isolates from the drinking bowl in piglet-care house had a higher resistant rate to all antibiotics. The isolatedEnterococcusstrains had 11 types of antibiotic-resistant spectrum; eleven strains were resistant to 4～5 kinds of antibiotics, and 5 strains of them were isolated from the drinking bowl in piglet-care house. The isolates from water inlet of pool and impounding reservoir had a lower multiple resistant rate than those from drinking bowl, and the isolates from the drinking bowl in piglet-care house had the highest multiple resistant rate.

Pig farm; Drinking water;Enterococcus; Antibiotic; Resistance; Drinking-water pipe network

2017-04-02

林云琴(1972—)，福建福清人，畜牧师，研究方向：畜牧、畜禽饲料及饲养管理。

S852.6

A

1001-8581(2017)08-0099-06