壮骨止痛方对骨质疏松大鼠Wnt/β-catenin信号通路、血清Sclerostin水平的影响※

● 杨 军 莫新民

壮骨止痛方对骨质疏松大鼠Wnt/β-catenin信号通路、血清Sclerostin水平的影响※

● 杨 军1*莫新民2

目的：探讨壮骨止痛方对骨质疏松雌鼠Wnt/β-catenin信号通路以及Sclerostin含量的影响。方法：将实验动物分为假手术组、模型组、壮骨止痛方高剂量治疗组、壮骨止痛方低剂量治疗组、雌二醇组5组，用酶联免疫法测定大鼠血清中β-catenin、Sclerostin的水平。结果：模型组大鼠血清β-catenin降低、Sclerostin水平上升，经壮骨止痛方药物干预后，大鼠血清β-catenin水平明显升高、Sclerostin水平明显下降。结论：壮骨止痛方药物可以提升Wnt/β-catenin信号通路的表达，降低血清Sclerostin的水平，达到预防治疗骨质疏松的作用。

壮骨止痛方 β-链蛋白 骨硬化蛋白

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以骨量减少，骨小梁变细、断裂、数量减少，皮质骨多孔、变薄等骨的微观结构退化为特征，以致骨的脆性增高及骨折危险性增高的一种全身性骨病[1]。随着人口老龄化的迅速到来，骨质疏松症已成为严重的社会问题，其发病率已经跃居世界各种常见病的第7位。壮骨止痛方是湖南省名中医、吾之业师莫新民教授研发而成，为治疗骨质疏松症的新药，已经获得国家新药证书[国药证字Z20050125]，对绝经后骨质疏松症有良好疗效[2-5]。本研究以经典的骨质疏松动物模型，用壮骨止痛方药物进行干预治疗，分别检测不同组别大鼠血清中的β-catenin、Sclerostin的比率，从而探讨壮骨止痛方预防治疗骨质疏松的作用机制，为再次临床开发应用提供依据。

1 材料

1.1 实验药物 壮骨止痛方药物由陕西中医药大学附属医院药剂科提供，动物灌胃前制备成混悬液，戊酸雌二醇(生产企业：拜耳医药保健有限公司广州分公司，药品批准文号：国药准字J20130009)。

1.2 实验动物 SD大鼠50只，SPF级，体重(200±20)g，雌鼠，购自第四军医大学实验动物中心，合格证号：SCXK-(军)2012-0007。动物饲养于清洁级饲养室，期间自由饮水、摄食，室温20～25℃，湿度40%～70%，光照周期12h/12h，通风良好。

1.3 试剂与仪器 青霉素(华北制药股份有限公司，国药准字H13020655)；大鼠硬骨素(SOST)ELISA检测试剂盒，大鼠β-链蛋白(β-catenin)ELISA检测试剂盒均购自(E20160801A，苏州尔卡文生物科技有限公司)。ELX808-IU酶标仪(美国宝特)；BT-25S型电子天平(上海)，0.5-10μl、2-20μl、1-200μl，200-1000μl移液枪。

2 方法

2.1 动物造模 采用国内外公认的雌性大鼠去卵巢3个月造成绝经后骨质疏松症病理模型[6]，取同批次250g左右的雌性SD大白鼠共40只，月龄10～12个月。按体重将大鼠随机分为假手术组、模型组、壮骨止痛方高剂量治疗组(13.2g/kg/d)、壮骨止痛方低剂量治疗组(3.3g/kg/d)、雌二醇组(0.167mg/kg/d)共5组，每组10只。除假手术组外，其余4组均切除双侧卵巢造成绝经后骨质疏松症病理模型，术后在大鼠大腿肌肉内侧，注射青霉素，每只4万u/d，防止术后感染。

2.2 给药方法 假手术组和模型组每天灌胃以相应体积冷开水，壮骨止痛方治疗组、己烯雌酚组灌胃以相应药物，剂量按成人剂量及人鼠体表面积折算确定。各组均从第5天拆线后开始给药，每天灌胃一次，连续12周。(实验过程中，可能由于术后处理不当，模型组和低剂量组各有一只肠胀气死亡)。

2.3 标本采集 给药12周，最后一次灌胃后2小时，腹腔注射2%的戊巴比妥钠(0.2ml/100g体重)麻醉，腹部切口，从腹主动脉取血，人道主义处死大鼠，分离血清后，再转放入-80℃冰箱中保存备用待分析。

2.4 指标检测 指标检测前，严格按试剂盒说明书进行相关项目的测定。主要测定大鼠血清β-catenin，Sclerostin比率变化，方法为酶联免疫分析。

3 结果

3.1 壮骨止痛方药物对绝经后骨质疏松症大鼠血清β-catenin的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清中β-catenin含量明显下降(P<0.01)，说明绝经后骨质疏松症大鼠造模成功；与模型组比较，雌二醇阳性药组大鼠血清中β-catenin含量明显升高(P<0.01)，壮骨止痛方高、低剂量给药组血清中β-catenin含量也显著升高(P<0.05)，均有统计学差异，提示壮骨止痛方药物对升高绝经后骨质疏松症大鼠血清β-catenin含量有较好作用。见表1。

3.2 壮骨止痛方药物对绝经后骨质疏松症大鼠血清Sclerostion的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清中Sclerostin含量明显升高(P<0.01)，有显著差异；与模型组比较，壮骨止痛方高剂量给药组和雌二醇阳性药组大鼠血清中Sclerostin含量明显下降(P<0.01)，壮骨止痛方低剂量给药组血清中Sclerostin含量显著下降(P<0.05)，提示壮骨止痛方药物对降低绝经后骨质疏松症大鼠血清SOST含量有较好作用。见表2。

表1 各组大鼠血清中β-catenin水平的变化

注：与假手术组比较，#P<0.05，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

表2 各组大鼠血清中Sclerostin水平的变化

注：与假手术组比较，#P<0.05，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

壮骨止痛方由补骨脂、淫羊藿、枸杞、党参、白术、芍药、骨碎补、丹参、甘草等九味药物组成，方中补骨脂、淫羊藿补肾气，温肾阳，善治腰脚疼痛之疾，淫羊藿又能“壮腰膝，通经络”，为君药；党参、白术益气健脾，补益后天，为肝肾提供生化之源；枸杞在《景岳全书·本草正》中云其“味重而纯，故能补阴，阴中有阳，故能补气……其功则明耳目，添精益髓，健骨强筋”，以上共为臣药；芍药、甘草组合，为芍药甘草汤，《伤寒论》云其具有“脚挛急”，可以治疗、缓解骨质疏松疼痛症状，为佐药；丹参，不仅能补肝血以强筋骨，尚能在滋腻之群中轻疏灵动，通调经脉而活血祛瘀，兼有“调血”之职，为使药。总之，壮骨止痛方既着重补肾气、温肾阳，又兼顾滋补肝肾阴精，以冀阳中求阴，阴中求阳，阴阳互生，加用丹参等通经活络之品，标本兼顾，补而不滞，是该方具有补益肝肾、壮骨止痛之功，为治疗骨质疏松症的良药。

现代研究证实，Wnt信号通路有3条，其中之一经典信号通路即Wnt/β-catenin信号对骨生物学显得尤为重要[7-8]，其通过多种途径增加骨量，包括更新干细胞、刺激前成骨细胞复制、诱导成骨细胞发生、抑制成骨细胞和骨细胞凋亡等。Wnt/β-catenin信号通路作用的关键分子是血清β-链蛋白(β-catenin)，它和骨骼的发育联系密切：Hu[9]等人报道了β-catenin通路在骨生成中的重要性，评估了β-catenin基因敲除的小鼠的骨发育；证明了β-catenin信号对成骨细胞完成分化过程是必要的。Hill等人[10]利用小鼠模型研究β-catenin在肢体和头间质中的作用，发现β-catenin在成骨细胞分化的早期也是必需的。本次实验表明，在模型组大鼠组中，因为成功复制了雌鼠骨质疏松的模型，与假手术组相比，模型组大鼠血清β-catenin含量的明显下降，但是通过壮骨止痛方药物的干预，尤其是高剂量组的药物，大鼠血清中β-catenin的含量明显升高，与模型组比较P<0.05，有显著的疗效，说明壮骨止痛方药物可以有效提升雌鼠骨质疏松症的血清β-catenin的含量，从而激活Wnt/β-catenin信号通路，从而达到治疗骨质疏松症的临床作用。

骨硬化蛋白(Sclerostin)，又称硬骨素，是近年来发现的一种由基因编码、骨原性细胞分泌的具有抑制骨形成作用的糖蛋白，已有研究显示，在很多疾病中骨硬化蛋白水平高于正常人，如固定导致的骨质疏松、血液透析、类风湿关节炎、原发性甲状腺功能亢进等。Huang QY等人研究表明，绝经后女性骨硬化蛋白水平高于绝经前女性[11]。因此提示骨硬化蛋白具有抑制骨形成的作用。本次实验表明，与假手术组相比较，模型组大鼠的Sclerostin的水平明显升高，说明造模骨质疏松大鼠的骨质在骨硬化蛋白的作用下发生变化，但是经过壮骨止痛方药物(特别是高剂量组)干预后，Sclerostin的水平明显下降，P<0.01，从而说明壮骨止痛方能够降低Sclerostin水平的表达，达到预防治疗骨质疏松的作用。

总之，壮骨止痛方可以抑制大鼠血清Sclerostin水平的表达、提高大鼠血清β-catenin水平的表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，达到干预骨质疏松症的作用。

[1]刘忠厚.骨质疏松学[M].北京：科技出版社，1998：142.

[2]杨 军，张小莉，刘仕杰，等.齐墩果酸对去卵巢骨质疏松症雌鼠的疗效及机理研究[J].时珍国医国药，2013，24(7)：1564-1566.

[3]刘仕杰，莫新民，李劲平，等.淫羊霍苷对去卵巢骨质疏松症雌鼠的疗效及机理初步研究[J].中国中医基础医学杂志，2012，18(3)：271-272.

[4]杨 军，张小莉，莫新民.基于蛋白质组学壮骨止痛方治疗骨质疏松症的作用机理研究[J].北京中医药大学学报，2013，36(12)：817-820.

[5]莫新民，曾 英，洪 净.去卵巢后雌鼠骨质疏松症模型相关局部因子检测[J].中国中医基础医学杂志，2002，8(4)：37-38.

[6]李素萍.骨质疏松动物模型的研究现状[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(20)：3767-3770.

[7]Westendorf JJ，Kahler RA，Schroeder TM.Wnt signaling in osteoblasts and bonediseases[J].Gene，2004，341：19-39.

[8]Rawadi Q Roman-Roman S，Wnt signalling pathway：a new target for the Treatment of osteoporosis[J].Expert Opin Ther Targets，2005，(5)：1063-1077.

[9]HuH，Hilton MJ，Tu X，et al.Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling inosteoblast development[J].Development，2005，132(1)：49-60.

[10]Hill TP，Spater D，Taketo MM，etal.Canonical Wnt/beta-catenin signalingprevents osteoblasts from differentiating into chondrocytes[J].Dev Cell 2005，8(5)：727-38.

[11]Huang QY，GHY，Kung，AWC.The-9247 T/C Polymorphism in the SOST upstream regulator region that potentially affects GEBPalpha and FOXA1 binding is associated with osteoporosis[J].Bone，2009，45(2)：289-94.

陕西省教育厅自然专项计划基金项目(No.15JK1212)

杨军，男，医学博士，副教授、副主任医师。主要从事经方治疗老年病的研究。

1.陕西中医药大学(712046)；2.湖南中医药大学(410007)