隔药饼灸对功能性消化不良肝郁脾虚模型大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α的影响※

康乐 蔷薇 叶意红 刘秋佳 刘未艾

（1湖南中医药大学第二临床学院，湖南长沙410007；2湖南中医药大学第二附属医院针灸-脑病科，湖南长沙410005）

隔药饼灸对功能性消化不良肝郁脾虚模型大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α的影响※

康乐 蔷薇1叶意红1刘秋佳1刘未艾2*

（1湖南中医药大学第二临床学院，湖南长沙410007；2湖南中医药大学第二附属医院针灸-脑病科，湖南长沙410005）

目的观察隔药饼灸对功能性消化不良（Functional Dyspepsia，FD）肝郁脾虚型模型大鼠血清白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影响，探讨隔药饼灸治疗FD的另一可能作用机制。方法将50只SD大鼠根据随机数字表法随机分为5组，空白组、模型组、隔药饼灸组、艾炷灸组、逍遥散组每组各10只，空白组正常饲养，其余4组均采用复合病因法(慢性束缚应激+过度疲劳+饮食失节+夹尾+摇晃)进行造模，造模21 d后按被试因素分组治疗14d，采用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测大鼠血清中IL-6、IL-1β及TNF-α的含量。结果与空白组比较，模型大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α含量均增加，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，隔药饼灸组、艾炷灸组、逍遥散组大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均下降(P＜0.01)，且隔药饼灸组效果优于艾炷灸组、逍遥散组，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与艾炷灸组比较，隔药饼灸组、逍遥散组大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论隔药饼灸可能是通过下调促炎因子，纠正IL-6、IL-1β及TNF-α的失衡，促进胃肠动力恢复，从而达到治疗该病的目的。

隔药饼灸；功能性消化不良；肝郁脾虚模型；IL-6；IL-1β；TNF-α；动物实验

功能性消化不良是一种非器质性疾病，在消化系统中比较常见，其主要临床表现为持续性或反复发作性上腹疼痛或不适感，伴有嗳气、腹胀、早饱、恶心或呕吐等症状。FD的患病率在不同的人群中表现不同，流行病学调查表明，欧美国家患病率在20%～25%，亚洲国家发病率约为8%～25%[1-2]。我国FD的患病率总体偏高，国内Yan-Qing Li对5000名在校大学生的问卷调查研究显示FD的患病率为9.25%，其中女性患病率高于男性[3]。至今为止，关于FD的病因及发病机制还没有完全明确，有研究表明[4-5]FD的发病与内脏高敏感性、胃肠动力障碍、外周血免疫激活、炎症及心理因素等有关。现有研究发现，在人体免疫防御系统中，胃肠道黏膜以及黏膜中相关淋巴组织、胃肠分泌和运动功能的完整、位于胃肠道的炎症免疫细胞和一些细胞因子，发挥着局部免疫防御与监视作用，在自身免疫耐受和免疫调节中发挥不可或缺的作用[6-7]。我们课题组在前期的研究中发现隔药饼灸能改善肝郁脾虚模型大鼠的胃肠动力，表明隔药饼灸对功能性胃肠病有良好的治疗效果[8-9]。本实验旨在前期研究的基础上，通过观察隔药饼灸对FD肝郁脾虚型大鼠血清中IL-6、IL-1β及TNF-α含量的影响，进一步探讨隔药饼灸治疗肝郁脾虚型FD可能的作用机制，为隔药饼灸治疗FD提供更客观的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物由湖南中医药大学动物实验中心提供的50只SPF级SD大鼠(动物合格证号：SCXK(湘)2013-0004)，雌雄各半，月龄约3个月，体重约220g。饲养温度25℃，湿度50%～70%。

1.2 药物及主要实验器材、试剂逍遥散中药饮片(购自湖南省中医院中药房)；太极灸(出口型)；自制的简易艾灸底座；ELISA试剂盒(长沙维世尔生物科技有限公司)；BCD-245F普通冰箱(荣事达)；台式冷冻离心机(湘仪，TGL-16)；酶标仪(汇松，MB-530)；全自动酶标洗板机(汇松，PW-812)；恒温振荡器(强乐，THZC)。

1.3 研究方法

1.3.1 动物分组将SD健康大鼠50只(SPF级)编号，按随机数字表将大鼠随机分为空白组和模型组，其中空白组10只(雌雄各半)，造模结束后，取造模成功的大鼠40只再按随机数字表法随机分为模型组、隔药饼灸组、艾炷灸组和逍遥散组4组，每组10只(雌雄各半)。

1.3.2 造模及给药参照岳利峰等[10]采用复合病因法造模，用慢性束缚应激+过度疲劳+饮食失节的方法，束缚同时夹尾30 min、摇晃5 min。实验前将所有大鼠进行预游泳，剔除游泳时间小于10 min、大于20 min的大鼠，预游泳合格的造模大鼠每天早晨8:00置于束缚盒中束缚3 h，同时夹尾30 min、摇晃5 min，下午14:00置于盛有温水的大塑料桶中游泳10 min（水温约22℃左右）。隔日足量给食，隔日禁食，连续21 d。空白组正常饲养，不做任何处理；模型组造模后每日行捆绑束缚30 min，并灌服0.9%氯化钠注射液，灌胃容积均为1 ml/100 g体质量(下同)；隔药饼灸组造模后行隔药饼灸30 min，并灌服0.9%氯化钠注射液；艾炷灸组造模后行艾炷灸30 min，并灌服0.9%氯化钠注射液；逍遥散组造模后行捆绑束缚30 min，灌服逍遥散水煎剂1 ml/100 g，共14 d。

1.3.3 施灸方法(1)选穴：I组：肝俞、脾俞、胃俞；II组：章门、期门、中脘（均为双侧）。取穴定位参照新世纪全国高等中医院校规划教材《实验针灸学》[11]及华兴邦的大鼠穴位图谱[12]。

(2)隔药饼灸法：隔药饼灸的艾炷选用韩国出口“太极灸”艾炷，隔药饼的药物组成及药饼制作：取柴胡、茯苓、白术、白芍、陈皮、防风六味药按等比例剂量研为粉末，并加入促透剂（冰片、氮酮）用醋调成糊状，通过自制的艾灸底座模具捏压成厚约2 mm、直径为1 cm±0.1 cm的药饼。每日8:00将大鼠捆绑束缚于鼠板上，取穴定位剪毛后用细绳将放置好药饼的艾灸底座固定在穴位上，然后将直径为0.5 cm±0.2 cm，高度为0.8 cm±0.1 cm的艾炷穿过自制模具的铁纤放在药饼上，点燃施灸，待艾炷燃完且余热散尽后，再换另一壮，每穴连续灸4～5壮(约30 min)，1次/d，I、Ⅱ组穴位隔日交替施灸，连续治疗14 d。艾炷灸法：于造模后的第1天同时施加灸法治疗，将大鼠捆绑束缚于鼠板上，取穴定位剪毛后，将直径为0.5±0.2 cm的太极灸艾炷粘在穴位上，点燃施灸，待艾炷燃完且余热散尽后，再换另一壮，艾灸时间、次数、取穴及疗程同隔药饼灸组。

1.3.4 逍遥散水煎剂制备柴胡∶当归∶白芍∶白术∶茯苓∶甘草∶薄荷∶煨姜根据2∶2∶2∶2∶2∶1∶1∶1的比例进行配方。先将以上药物(薄荷除外)用蒸馏水浸泡1 h，后用武火煎至沸腾，再以文火煎煮2 h，薄荷于起锅前10 min放入，药汁用纱布过滤；药渣再加入蒸馏水用文火煎煮1 h后过滤取药汁。两次药汁合并，再将药汁浓缩至含生药2 g/ml，放于4℃冰箱保存备用。

1.3.5 指标观察和检测方法IL-6、IL-1β及TNF-α的取材：实验结束后，禁食24 h，用20%乌拉坦4 mL/kg腹腔内注射麻醉后，予腹主动脉采血，常温放置2 h，4℃3000 rpm，离心15 min，取上清液，-20℃保存待测。采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α的水平，操作步骤严格按说明书进行。

1.4 统计方法用SPSS17.0软件进行处理。全部统计数据用（x±s）表示，先进行正态性和方差齐性检验。满足正态性和方差齐性者，采用单因素方差分析，组间比较用LSD检验；不满足正态性和方差齐性者，多组计量资料比较采Kruskal-Wallis H秩和检验，组间比较采用Wilcoxon秩和检验和Mann-Whitney U检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

由表1可见，与空白组比较，模型组大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，隔药饼灸组、艾炷灸组、逍遥散组大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均下降(P＜0.01)，且隔药饼灸组效果优于艾炷灸组及逍遥散组，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与艾炷灸组比较，隔药饼灸组、逍遥散组大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)。说明隔药饼灸组、艾炷灸组及逍遥散组能明显降低FD肝郁脾虚模型大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α的含量，而隔药饼灸组的疗效更优于艾炷灸组及逍遥散组。

表1 各组大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α的比较(pg/ml，x±s，n=10)

3 讨论

FD是临床常见的一种非器质性消化系统疾病，FD的临床症状可单独或联合出现，主要表现为上腹胀满、嗳气、餐后饱胀、食欲不振、腹痛、腹泻等。中医认为本病病位在胃，与肝脾二脏关系甚密。《医方考》言：“泻责之脾，痛责之肝，肝责之实，脾责之虚，脾虚肝实，故令痛泻”。《四圣心源》曰：“木以发达为性，己土湿陷，抑遏乙木发达之气，生意不遂，故郁怒而克脾土，风动而生疏泄，凡腹痛下利，皆风木之疏泄也”。可见肝木以调达为畅，肝气郁结，失于疏泄，横逆犯脾胃，脾胃升清降浊功能失调，运化水湿失司，导致泄泻，故肝郁脾虚，肝旺乘脾，升降失常，为病机之关键。

本实验采用慢性束缚应激+过度疲劳+饮食失节的造模方法来建立肝郁脾虚模型大鼠，束缚应激可使大鼠产生烦躁欲怒的情志，导致肝气郁结，失于疏泄条达。过度疲劳及饮食失节致大鼠脾胃虚弱，生理功能紊乱，而出现胃肠功能减退。选用隔药饼灸做为本病的治疗方法，药饼的药物组成以逍遥散为主，有研究表明逍遥散能够改善慢性应激大鼠的便稀、摄食量减少以及体重过低等症状[13]，并能增强胃肠内容物的推进功能[14]。方中柴胡疏肝解郁，使肝气得以条达，木不达致脾虚不运，以茯苓、白术、陈皮健脾益气，白芍养血柔肝，防风散肝舒脾，六药合用，使肝郁得疏，脾弱得复。在选穴上采用俞募配穴法，取肝之背俞穴肝俞、募穴期门以疏肝理气解郁，调畅肝经气机而止痛止泻；胃之背俞穴胃俞、募穴中脘调理脾胃；脾之背俞穴脾俞、募穴章门以益气健脾和胃，升清降浊；诸穴合用，以达疏肝和胃、理气解郁、益气健脾之效。

近年来，有研究发现炎症因子在胃肠动力方面发挥着重要作用，有些胃肠动力疾病的组织学改变是以胃肠道的免疫细胞浸润为主，免疫细胞释放的炎症介质可介导胃肠动力改变[15]。IL-6作为炎性因子与胃肠道炎性反应存在一定的关联性[16]。Maruna等[17]用胃电图分别检测开腹胆囊切除术和腹腔镜下胆囊切除术的患者，发现胃肠动力障碍与全身炎症反应相关。进一步的研究显示IL-6的浓度与胃肠功能障碍的程度呈正相关，随着IL-6浓度的下降，胃肠动力则逐渐恢复。IL-1β既是促炎因子，也是炎症反应的重要介质，可刺激各种炎症细胞和免疫细胞，促进炎症介质及炎症蛋白的释放，对淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞有趋化作用，从而增强炎症反应[18]。研究表明[19]IL-1β能够抑制肠Na-K-ATP酶的活性，进而抑制水、钠吸收而引起腹泻，最终导致胃肠功能的紊乱。TNF-α是在炎症过程起重要作用的炎症因子，通过提高中性粒细胞的吞噬能力、促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上，从而刺激机体产生局部炎症反应。Papadakis等[20]研究表明，低浓度的TNF-α在肠黏膜内通过自分泌或旁分泌方式在局部发挥作用，诱发肠黏膜炎症反应。

本研究结果显示，FD肝郁脾虚模型大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均显著升高，中医肝郁脾虚相当于现代西医学所说的紧张、焦虑、抑郁等精神状态，这些不良情绪可以导致FD的发生，这两者之间相互影响。有研究表明FD患者血清IL-6水平显著高于正常健康受试者，且与焦虑、抑郁评分呈正相关[16]。IL-1β、TNF-α可刺激各种炎症细胞和免疫细胞，促进炎症介质的释放，从而导致胃肠功能的紊乱[19-20]。经隔药饼灸治疗后，FD模型组大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均显著下降，FD大鼠症状得到明显改善，逍遥散能明显减低IL-6、IL-1β及TNF-α等炎症因子的水平[21]。并且隔药饼灸具有集药物效应、温热效应及穴位刺激效应于一体的作用，三者合一，从而调节机体免疫，降低炎症反应，改善胃肠功能障碍，达到治疗FD的目的。这一结果表明，FD的发生可能与IL-6、IL-1β及TNF-α水平改变存在某些关联，推测炎症反应激活自身免疫在FD的发生中起一定的作用，并与IL-6、IL-1β及TNF-α刺激胃肠道神经元，使机体产生局部炎症反应，导致胃肠功能障碍有关。IL-6、IL-1β及TNF-α可能成为FD病情评估的指标之一。这对FD的认识提供了新视角，为临床治疗FD提供了新思路。

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Effect of Herbal Cake-separated Moxibustion on the Expression of Interleukin-6 Interleukin-1β and Tumor Necrosis Factor-α of Functional Dyspepsia Rats

KANG Leqiangwei1,YE Yihong1,LIU Qiujia1,LIU Weiai2
(1.Hunan University Of Chinese Medicine，Changsha，Hunan Province，410000；
(1.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Hunan Province,Changsha 410005,China; 2.Department of Acupuncture-Encephalopathy,the Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Hunan Province, Changsha 410005,China)

Objective To observe the effect of cake-separated moxibustion on interleukin-6,interleukin-1β and tumor necrosis factor-α of functional dyspepsia(FD)rats,and to explore the herbal cake-separated-moxibustion another possible mechanism for treatment of FD.Methods According to random number table method,50 SD rats were randomly divided into blank group,model group,herbal cake-separated moxibustion group,moxa-cone moxibustion group and Xiaoyao powder group,and each group had 10 rats.The blank group

normal feeding,the the rest of the four groups underwent modeling by applying chronic restraint stress,excessive fatigue,irregularfood,clip tail,shaking for 21 consecutive days.Then each group underwent treatment respectively for 14 days.At the end of the experiment,the contents of IL-6,IL-1β and TNF-α in rats serum were detected by enzyme linked immunosorbent assay method.Results As compared with blank group,the serum levels of IL-6,IL-1β and TNF-α in the model rats were increased,there had significant differences(P＜0.01).Comparing with the model group,the serum levels of IL-6,IL-1β and TNF-α were decreased in herbal cake-separated moxibustion group,moxa-cone moxibustion group and Xiaoyao powder group(P＜0.01),and herbal cakeseparated moxibustion group was better than moxa-cone moxibustion group and Xiaoyao powder group,and there had significant differences(P＜0.01).Comparing with tomoxa-cone moxibustion group,the serum levels of IL-6,IL-1β and TNF-α were decreased in herbal cake-separated moxibustion group and Xiaoyao powder group(P＜0.01),and there were significant differences(P＜0.01). Conclusion The cake-separated moxibustion may be via to down regulation of proinflammatory factors and correct the imbalance of IL-6,IL-1β and TNF-α,promote the recovery of gastrointestinal motility,so as to achieve the purpose of treatment of the disease.

cake-separated moxibustion;functional dyspepsia;liver stagnation and spleen deficiency model;IL-6;IL-1β;TNF-α; animal experiment

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.16.060

1672-2779（2017）-16-0137-04

：李海燕本文校对：付磊

2017-07-10）

国家自然科学基金【No.81173326，81303049】；湖南省中医药管理局项目【No.2013117，No.2015134】

*通讯作者：55999630@qq.com