石莼对磺胺甲恶唑和红霉素胁迫耐受性及指标表征

陈友媛,狄玥莉,卢 爽,吴 丹,孙 萍



石莼对磺胺甲恶唑和红霉素胁迫耐受性及指标表征

陈友媛1*,狄玥莉1,卢 爽1,吴 丹2,孙 萍1

(1.中国海洋大学环境科学与工程学院,海洋环境与生态教育部重点实验室,山东省海洋环境地质工程重点实验室,山东青岛 266100；2.山东省青岛市规划局,山东青岛 266100)

通过海水培养实验,分析了磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole, SMZ)和红霉素(erythromycin, ETM)胁迫下石莼生长、生理指标,探究石莼对SMZ和ETM的耐受性.并通过SMZ和ETM胁迫下石莼生理指标主成分分析,筛选SMZ和ETM胁迫响应表征指标.结果表明,低浓度SMZ(0.50mg/L)促进石莼生长,相对生长速率(RGR)显著升高(<0.05),而ETM³0.06mg/L抑制石莼生长.生理指标间接反映石莼对SMZ和ETM的耐受性.较高浓度SMZ(³2.50mg/L)和ETM(³0.18mg/L)破坏石莼细胞膜透性,相对电导率显著增加(<0.05);0.50~1.50mg/LSMZ和0.06~0.18mg/LETM开始抑制石莼光合作用,叶绿素a(Chla)含量、1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)活性显著下降(<0.05);1.50mg/LSMZ和0.06mg/LETM破坏石莼抗氧化系统平衡,引起过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量显著增加(<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性增加.综合生长和生理指标表明,SMZ胁迫浓度不超过0.50mg/L对石莼生长状况和生理代谢有促进作用,SMZ³1.50mg/L,ETM³0.06mg/L超过石莼耐受范围,对石莼造成毒害,且石莼对SMZ的耐受性优于ETM.主成分分析结果表明,表征SMZ胁迫下石莼细胞膜透性、光合作用、抗氧化系统变化的生理指标分别为相对电导率,FBA和类胡萝卜素(Car), MDA,而表征ETM胁迫下这3个生理过程的指标分别为相对电导率,FBA和Car, MDA、CAT和抗坏血酸过氧化物酶(APX).

石莼；磺胺甲恶唑；红霉素；耐受性；指标表征

抗生素作为广谱性抗菌药物被广泛用于人类及动物[1].但使用的抗生素仅部分参与代谢,另外高达90%以原药或代谢物形式进入环境[2],由于抗生素连续不断进入自然环境,因此被视为“伪持久性”污染物[3],环境中抗生素的潜在生态危害已越来越受到人们重视.已有研究表明抗生素广泛存在于海水环境中[4-6].磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole, SMZ)和红霉素(erythromycin, ETM)是检出率较高的两种抗生素[7-9],据报导中国广西北部湾频繁地检测到ETM和SMZ,对藻类物种如羊角月牙藻()和聚球藻()可以带来风险[10],另有研究表明黄海和渤海近岸水存在的ETM和SMZ可能对敏感水生生物带来风险[11].

残留抗生素对环境中一些非目标生物的不利影响已被证实,目前抗生素对藻类的毒性作用机制被认为包括以下几个方面:改变细胞成分如光合色素[12];抑制叶绿体基因表达,破坏光合系统[13];诱导产生自由基引发氧化胁迫[14].但研究多集中于羊角月牙藻()[15],小球藻()和金藻()[16]等微藻中,而缺乏大型藻类的研究.大型海藻作为初级生产者,污染物对其的影响可能会通过上行效应对高营养级生物产生影响,可以导致污染物的生物放大,且Leston等[17]提出大型海藻如石莼()也有作为生物监测物种指示生态压力的潜力[17],因而研究抗生素对大型海藻的影响意义重大.

本研究选择石莼为受试海藻,磺胺甲恶唑(SMZ)和红霉素(ETM)为目标污染物.通过研究主要达到以下两个目的:1)探讨SMZ和ETM胁迫下石莼的耐受性及环境浓度范围SMZ和ETM对石莼的潜在危害; 2)筛选SMZ和ETM胁迫生理响应表征指标.

1 材料与方法

1.1 实验材料

石莼(),又名海白菜、海菠菜、海莴苣等,绿藻门石莼科石莼属.大型经济海藻,广泛分布于沿海地区,全年生,基部固定于潮间带岩石而生,增长率较高,适温范围0~35℃,供试石莼购自海南文昌市.

磺胺甲恶唑(SMZ)购自麦克林公司(中国上海),纯度³98%,红霉素(ETM)购自源叶生物科技有限公司(中国上海),纯度³99%.

1.2 实验设计

购买石莼冷藏运输至实验室,用蒸馏水清洗后放入盐度为30‰的人工海水VSE培养液中缓苗7天.采用直径15cm、容积1L的塑料量杯进行室内水培实验,称取3g长势一致的石莼转入含0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mg/L SMZ和0、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42mg/L ETM的培养液中,分别编号为CK(对照组),T1,T2,T3,T4,T5,T6,T7,每个浓度设三组平行,实验室内自然光源培养,温度20~28℃,12d后取样测定.有研究表明,SMZ和ETM 4d降解率分别为4%(±3.3%)和13%(±4.7%)[14],因此本研究中为防止抗生素的过量自然降解,培养期间每4d更换一次培养液.

1.3 指标测定方法

1.3.1 生长指标 处理前后测量石莼鲜重,相对生长速率(RGR)通过公式(1)计算:

RGR(%/d)=[ln(M/0)]/·100% (1)

式中:M为时刻的鲜重, g;0初始时刻的鲜重, g.

1.3.2 一般生理指标 叶片相对电导率采用浸泡法测定[18],光合色素含量采用乙醇提取法测定[19],1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)活性采用谢利万诺夫法测定[20].

1.3.3 抗氧化系统指标 过氧化氢(H2O2)含量采用过氧化氢-四氯化钛法测定[21],丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定[19],超氧化物歧化酶(SOD)活性采用硝基四氮唑蓝光化还原抑制法测定[19],过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法测定[19],谷胱甘肽还原酶(GR)活性采用紫外比色法测定[22],抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性采用分光光度法测定[23].

1.4 实验仪器

TU-1810(普析,中国)紫外可见分光光度计.

1.5 统计分析

统计分析采用SPSS 19.0,通过单因素方差分析(ANOVA), Turkey检验各项测试指标在不同抗生素浓度<0.05水平上的显著性差异,通过主成分分析测试生理指标间的相关性,提取特征值>1的主成分进行生理指标筛选.

2 结果分析

2.1 SMZ和ETM胁迫下石莼的生长指标

表1 SMZ和ETM对石莼RGR的影响

注:数据为平均值±标准偏差,每个指标的同列数据后不同字母表示处理间差异显著(<0.05).

SMZ和ETM对石莼相对生长速率(RGR)产生影响(表1). 0.50mg/LSMZ胁迫下石莼RGR高于对照组10%,当SMZ浓度增加至1.50mg/L时石莼RGR开始受到轻微抑制,低于对照组34%,随SMZ浓度升高,其对石莼RGR的抑制作用也随之显著增加(<0.05),至3.50mg/L时抑制率达143%.与SMZ相比,ETM对石莼RGR的抑制作用更为显著(<0.05), 0.06mg/L的ETM对石莼RGR的抑制率即为74%,至0.42mg/L时抑制率增加到159%,远远大于3.50mg/LSMZ产生的抑制作用.

2.2 SMZ和ETM胁迫下石莼生理指标

2.2.1 一般生理指标 SMZ和ETM还对石莼相对电导率、叶绿素a(Chl a)、类胡萝卜素(Car)、1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)产生影响.相对电导率可以表征植物细胞膜受损程度,与其呈正相关[24], SMZ和ETM胁迫下其变化趋势见图1.石莼相对电导率在SMZ 3.00mg/L时开始显著增加(< 0.05),高于对照组23%,而ETM在0.18mg/L时就表现出显著性差异(<0.05),高于对照组15%,至0.42mg/L时增幅为28%,与SMZ 3.50mg/L处理下的值相当.石莼相对电导率在SMZ和ETM相对较高浓度时才显著增大(<0.05),与生长指标相比,SMZ和ETM对石莼细胞膜透性的破坏具有滞后性.

数据上方不同字母表示处理间差异显著(<0.05)

光合色素是植物光合作用中能量捕获及传递的重要物质,其含量高低反映了光合作用强弱[25],此外Car还是一种清除自由基的重要非酶抗氧化剂[26].SMZ和ETM对石莼Chl a和Car含量的影响见表2. Chl a和Car含量均随SMZ和ETM浓度升高而先增加后降低.Chl a含量在SMZ 1.00mg/L和ETM 0.06mg/L时增至最大,分别高于对照组13%和20%,之后其含量开始下降,在SMZ 3.50mg/L,ETM 0.42mg/L时达最大降幅分别为29%和41%. Car含量与Chl a含量变化趋势相似,但其上升趋势更显著而下降趋势不明显,在SMZ 1.50mg/L,ETM 0.24mg/L时分别达最大增幅为36%和55%,而在SMZ 3.50mg/L,ETM 0.42mg/L时最大降幅仅为6%和7%.

表2 SMZ和ETM对石莼光合色素含量的影响

注:数据为平均值±标准偏差,每个指标的同列数据后不同字母表示处理间差异显著(<0.05).

数据上方不同字母表示处理间差异显著(<0.05)

FBA是植物光合作用卡尔文循环中催化碳固定的关键酶,也是植物进行光合作用的限速酶[27-28], FBA活性高低也反映了植物光合作用强弱.SMZ和ETM胁迫下其活性变化见图2. 0.50mg/L SMZ和0.06mg/L ETM即对石莼FBA活性产生抑制,至SMZ 3.50mg/L和ETM 0.42mg/L时对石莼酶活最大抑制率分别为41%和42%.

数据上方不同字母表示处理间差异显著(<0.05)

2.2.2 抗氧化系统指标 SMZ和ETM对石莼过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量的影响分别见图3a、图3b. H2O2是活性氧(ROS)的一种,会对植物产生氧化损伤,其含量随SMZ和ETM浓度增加而增加.1.50mg/LSMZ胁迫下石莼H2O2含量显著增加(<0.05),高于对照组36%,而ETM在0.06mg/L时即引起石莼H2O2含量显著增加(<0.05),高于对照组11%,至0.42mg/L时高于对照组71%.MDA是植物受到ROS损害后细胞膜脂质过氧化反应产物,其含量高低反映了细胞内氧化应激水平与细胞质膜损害程度[29].石莼MDA含量变化与H2O2相似,1.50mg/L SMZ引起石莼MDA含量显著高于对照组15%,至3.50mg/L时增幅达105%, ETM在0.06mg/L时引起石莼MDA含量高于对照组24%,至0.42mg/L时增幅为117%.

超氧化物歧化酶(SOD)、氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)是植物体内重要的抗氧化酶,SMZ和ETM胁迫下石莼体内4种抗氧化酶活性变化分别见4a、图4b、图4c和图4d.其中SOD活性、CAT活性和GR活性均随SMZ和ETM浓度增加而增加,但在SMZ高浓度(>3.00mg/L)时CAT和GR活性呈下降趋势,在ETM高浓度 (>0.30mg/L)时SOD和CAT活性呈下降趋势.在SMZ 3.50mg/L时石莼SOD活性最大,高于对照组138%,在3.00mg/L时石莼CAT和GR活性达最大,分别高于对照组38%和252%,分别在ETM 0.30mg/L、0.24mg/L和0.42mg/L时石莼SOD、CAT和GR活性达最大,高于对照组229%、35%和318%.与前三种酶活性变化趋势不同,SMZ胁迫下APX活性无显著变化,而ETM胁迫下其活性受到抑制,与浓度呈负相关,在ETM 0.42mg/L时最大抑制率为76%.

2.3 石莼生理指标主成分分析

为简化指标体系,对测试的10个生理指标进行主成分分析,结果见图5. SMZ和ETM胁迫组生理指标都提取为2个主成分,累计贡献率分别为87.884%和85.843%.

其中SMZ胁迫下相对电导率、H2O2、MDA、SOD、CAT、APX、GR与第一主成分呈正相关, Chl a、FBA与第一主分呈负相关,它们都对第一主成分有较大的贡献率,只有Car与第二主成分呈正相关.第一主成分中相对电导率植物表征细胞膜透性,Chl a、FBA都是植物光合作用指标,选择特征值较大的FBA为表征指标, H2O2、MDA、SOD、CAT、APX、GR都是植物抗氧化系统相关指标,选择特征值较大的MDA为表征指标,综合第二主成分中的Car, SMZ胁迫响应表征指标筛选为相对电导率、FBA、MDA和Car.同理, ETM胁迫响应表征指标筛选为相对电导率、FBA、MDA、Car、APX和CAT.

综上所述,本研究SMZ胁迫响应表征指标为相对电导率, FBA和Car,MDA,分别表征石莼在SMZ胁迫下细胞膜透性、光合作用、抗氧化系统变化,而ETM胁迫下石莼这3个生理过程变化的响应表征指标分别为相对电导率,FBA和Car,MDA、CAT和APX.

3 讨论

3.1 SMZ和ETM胁迫下石莼生长生理响应

3.1.1 SMZ和ETM对石莼生长的促进作用 本研究观察到低浓度SMZ(0.50mg/L)对石莼具有类似激素的促生长作用,当浓度大于1.50mg/L时则抑制生长.这种对生长的低促高抑作用在有关抗生素的研究中已多有报道, 0.5~2.0mg/L的氟苯尼考促进中肋骨条藻()生长,而大于2.0mg/L时抑制其生长[30],四环素类抗生素对小麦(L.)幼苗生长和芽伸长的研究也观察到类似结果[31-32]. ETM对植物生长的低促高抑作用也已被证实,如Wan等[25]在水华微囊藻()和Pierattini等[33]在银白杨()中的发现.然而本研究中没有观察到ETM对石莼的该种作用,这可能是本研究中ETM最低浓度(0.06mg/L)高于其对石莼最高促进作用浓度的原因.

3.1.2 SMZ和ETM对石莼光合作用的抑制 本研究还观察到SMZ和ETM胁迫下石莼Chla含量和FBA活性下降,表明石莼光合作用受SMZ和ETM抑制.有研究证明抗生素通常作用于植物叶绿体[34],这是由于叶绿体属于半自主细胞器,与抗生素目标物细菌有相似结构甚至相似的进化起源[34],而且与原核生物(细菌)基因表达相似[35],因而极可能成为抗生素的目标物.多项研究结果也表明,抗生素大都作用于植物光合作用[35-37].抗生素对石莼的作用可能与此相同, SMZ和ETM对石莼的影响可能首先作用于叶绿体,干扰和抑制石莼光合作用,这可能是研究中观察到较低浓度SMZ和ETM胁迫下石莼Chla含量和FBA活性下降的原因.

另外,与其他光合作用指标相比,研究中未观察到SMZ和ETM对石莼Car含量的过度抑制,这可能是由于Car在减少自由基对DNA、RNA等细胞遗传物质和细胞膜的损伤[26]中有重要作用,而作为非酶抗氧化剂被激活造成的.

3.1.3 SMZ和ETM诱导氧化胁迫与石莼抗氧化系统响应 抗生素对植物影响的重要机制之一就是诱导产生ROS引发氧化胁迫[14].ROS对植物造成氧化损伤[38],但只有积累到一定程度,才会破坏植物细胞膜透性,石莼细胞膜透性变化的滞后性可由此解释.Nie等观察到ETM和SMZ胁迫下羊角月牙藻()发生脂质过氧化,MDA含量显著增加[14],杨弯弯等[39]也观察到恩诺沙星和硫氰酸红霉素处理下铜绿微囊藻MDA含量的增加.与其他研究一致,本研究也观察到石莼随SMZ和ETM浓度上升而不断增加的ROS和脂质过氧化水平,H2O2和MDA含量的上升表明此点.

植物通过增加抗氧化酶活性以清除体内积累的ROS. Nie等观察到SMZ胁迫下羊角月牙藻()的SOD、CAT和GR活性不断增强[14],Wan等观察到水华微囊藻()在ETM胁迫下SOD和CAT活性也显著增加[25].与其他研究一致,本研究SMZ和ETM胁迫下石莼SOD、CAT、GR活性增加,用来清除不断积累的ROS,抵抗氧化损伤.但在SMZ高浓度时CAT和GR活性下降,在ETM高浓度时SOD和CAT活性下降,这可能是随抗生素浓度增大,ROS水平持续增加,并且增加的抗氧化酶活性并不足以清除ROS,导致细胞内过度积累ROS而影响细胞膜透性,引起细胞功能障碍或死亡的原因.

与其他3种抗氧化酶活性变化趋势不同,本研究观察到石莼APX活性在SMZ胁迫下无显著变化,而ETM胁迫下显著下降(<0.05).这可能是由APX的抗氧化途径决定的. APX是清除光合系统中H2O2的重要酶,但APX催化H2O2依赖L-抗坏血酸(AsA)的氧化作用[40].已有研究表明ETM会抑制藻类AsA合成[14],且体外实验表明,在AsA缺失情况下,叶绿体APX在几分钟之内即会失活[38,41].ETM对石莼APX的抑制作用可能是由对AsA含量的抑制间接造成的.

3.2 SMZ和ETM胁迫下石莼的耐受性

综合生长和生理指标表明,SMZ浓度不低于1.50mg/L及所有浓度ETM(³0.06mg/L)抑制石莼生长和光合代谢,并诱导产生氧化应激,破坏抗氧化系统平衡.

石莼对SMZ的耐受性优于ETM.这一部分可能归因于抗生素辛醇-水分配系数(logow)的差异, logow是药物亲水性的重要指标,也是抗生素通过水的运输和被动吸收,被生物吸收的主要因素[42-43].它可以用来预测药物在水生生物体内富集潜力[4],富集浓度与其呈正相关.硝基呋喃和磺胺噻唑对石莼的影响研究中发现,石莼中硝基呋喃(logow=0.2)含量高于磺胺噻唑(logow=0.05)[17,44],与logow正相关. ETM的logow(logow=2.48)远远大于SMZ(logow= 0.89)[45],石莼中可能富集更多ETM,从而可能引起更显著的生长和生理响应.

海水中SMZ和ETM的检出浓度因环境而异, Zhang等在中国400公里近海岸水域检测到SMZ和ETM浓度在0.1~8.7ng/L范围内[11],海水养殖环境中的抗生素浓度较高,但整体上SMZ和ETM浓度分别在0.6~765ng/L和0.1~1900ng/L范围内[46].本研究中石莼对这两种抗生素的耐受浓度较高,因此海水环境中的SMZ和ETM单独存在且作用时间较短时,对石莼的潜在危害较低.但在海水生态系统中多种抗生素并存并具有一定的持久性,因此环境浓度范围的抗生素对生物体的综合和累积影响不可忽略,仍需进一步研究.

4 结论

4.1 石莼生长指标表明, SMZ对石莼具有低促高抑的毒物兴奋效应.

4.2 SMZ和ETM胁迫下石莼的生长、生理指标表明,当SMZ和ETM浓度分别在³1.50mg/L和³0.06mg/L时石莼受到毒害,石莼对SMZ的耐受性优于ETM.

4.3 石莼对SMZ和ETM较高的耐受性表明,目前调查到的海水环境中的SMZ和ETM浓度单独作用时对石莼的潜在危害较低.

4.4 本研究中的测试生理指标主成分分析结果表明, SMZ胁迫下石莼细胞膜透性、光合作用、抗氧化系统变化的表征指标分别为叶片相对电导率, FBA和Car, MDA, ETM胁迫下这3个生理过程的表征指标分别为叶片相对电导率, FBA和Car, MDA、CAT和APX.

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致谢：感谢中国海洋大学环境科学与工程学院水土污染分析实验室成员对实验过程提供的帮助！

Tolerance and indicator characteristics ofunder sulfamethoxazole and erythromycin stress.

CHEN You-yuan1*, DI Yue-li1, LU Shuang1, WU Dan2, SUN Ping1

(1.Key Laboratory of Marine Environmental Science and Ecology, Ministry of Education; Shandong Provincial Key Laboratory of Marine Environment and Geological Engineering; College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China；2.Urban Planning Bureau, Qingdao 266000, China)., 2017,37(8)：3114~3122

In order to gain fundamental insights into the tolerance and response characteristics ofunder SMZ (Sulfamethoxazole) and ETM (erythromycin) stress, the seawater culture experiment was conducted and a PCA (principal components analysis) was used to investigate its growth and physiology characteristics. The results showed that the growth ofwas promoted at a low-level concentration of SMZ (0.50mg/L), which was indicated by the significant elevation of the RGR (relative growth rate) (<0.05). However, the growth ofwas inhibited at ETM³0.06mg/L. In addition, the physiological parameters indirectly reflected the tolerance ofunder SMZ and ETM stress. The cell membrane permeability ofwas destructed at a relatively high-level concentration of SMZ (³2.50mg/L) and ETM (³0.18mg/L), which was supported by the significant increase of the relative conductivity (<0.05). The photosynthesis ofbegan to be inhibitedat 0.50~1.50mg/L of SMZ and 0.06~0.18mg/L of ETM, indicated by the significant decrease of the Chla (chlorophyll a) content and the FBA (1, 6-diphosphate aldolase) activity (<0.05). Significantly increases of H2O2(hydrogen peroxide) content, MDA(malondialdehyde) content (<0.05) and SOD (superoxide dismutase), CAT (catalase) and GR (glutathione reductase) activities were observed under 1.50mg/LSMZ and 0.06mg/L ETM stress, which indicated the destruction of the antioxidant system balance. The results showed that the growth and metabolism ofcould be promoted at SMZ concentration of 0.50mg/L, but SMZ³1.50mg/L and ETM³0.06mg/L were beyond the tolerance capacity of, andwas less vulnerable to SMZ stress than ETM stress. The PCA results showed that response indicators for cell membrane permeability, photosynthesis and antioxidant system ofunder SMZ stress were the relative electrical conductivity, FBA and Car (carotenoid), MDA, respectively, while under ETM stress were relative conductance, FBA and Car, MDA、CAT and APX (ascorbate peroxidase), respectively.

；sulfamethoxazole；erythromycin；tolerance；indicator characteristics

X171

A

1000-6923(2017)08-3114-09

陈友媛(1966-),女,江西永新人,博士,副教授,主要研究方向为水土污染控制与修复技术.发表论文60余篇.

2017-01-20

青岛市科技攻关项目(12-4-1-58-HY);青岛市政府采购项目(T-20150205-018)

* 责任作者, 副教授, youyuan@ouc.edu.cn