LRIG1在卵巢浆液性囊腺癌细胞对依托泊苷敏感性中的作用研究*

阳华，叶元，肖胜军，雷小妹，罗小红

（1.桂林医学院第二附属医院 妇科，广西 桂林 541199；2.桂林医学院附属医院 妇科，广西 桂林 541001；3.桂林医学院第二附属医院 病理科，广西 桂林 541199；4.桂林医学院附属医院 统计室，广西 桂林 541001）

基础研究·论著

LRIG1在卵巢浆液性囊腺癌细胞对依托泊苷敏感性中的作用研究*

阳华1，叶元2，肖胜军3，雷小妹1，罗小红4

（1.桂林医学院第二附属医院 妇科，广西 桂林 541199；2.桂林医学院附属医院 妇科，广西 桂林 541001；3.桂林医学院第二附属医院 病理科，广西 桂林 541199；4.桂林医学院附属医院 统计室，广西 桂林 541001）

目的 探讨亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域基因-1（LRIG1）在卵巢浆液性囊腺癌（SKOV3）细胞株中对依托泊苷敏感性的可能机制。方法 噻唑蓝比色法（MMT）检测不同浓度VP16干预下48 h的SKOV3细胞组、siRNA LRIG1转染SKOV3细胞组、SKOV3/VP16细胞组和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞组的增殖。平板克隆检测细胞增殖，流式检测细胞凋亡情况，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测LRIG1 mRNA表达。结果 半抑制浓度（IC50）分别为62.90、115.49、156.50和195.42μg/L，siRNALRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16的耐药指数分别为1.8、2.5和3.1。SKOV3、siRNA LRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞组的克隆率（F=39.338，P=0.000），细胞的LRIG1 mRNA（F=63.095，P=0.000）和凋亡细胞（F=230.046，P=0.000）明显不同，与 SKOV3 比较，siRNA LRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增加（t=0.026、0.0710和0.125，P=0.042、0.000和 0.000），细胞的 LRIG1 mRNA 降低（t=0.130、0.525和 0.825，均 P=0.000），凋亡细胞减少（t=12.350、35.506和 44.412，均 P=0.000），与 siRNA LRIG1转染 SKOV3比较，SKOV3/VP16和 siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增加（t=0.044和0.099，P=0.001和0.000），LRIG1 mRNA降低（t=0.395和0.695，均 P=0.000），凋亡细胞减少（t=23.156 和 32063，均 P＜0.05），与 SKOV3/VP16 比较，siRNA LRIG1 转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增加（t=0.055，P=0.000），细胞的 LRIG1 mRNA降低（t=0.300，P=0.000），凋亡细胞减少（t=8.906，P=0.000）。结论 LRIG1 mRNA影响SKOV3细胞对药物的敏感性，沉默LRIG1的耐药细胞可抑制SKOV3细胞凋亡。

卵巢癌；耐药；亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域基因-1

当今，卵巢癌的发生率已经呈现出不断上升的趋势，成为危害女性的重要杀手，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第3位，卵巢肿瘤中的卵巢上皮癌的死亡为女性各种肿瘤死亡之首，可见卵巢肿瘤已严重危害女性生命健康。随着化疗药物使用的增加，卵巢癌细胞的耐药性也逐渐受到了人们的关注。富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域基因 -1（leucine-rich repeats and immunoglobulinlike domains-1，LRIG-1）及其家族分子LRIG-2和LRIG-3是一类新兴的肿瘤抑制分子，在多种恶性肿瘤如乳腺癌[1-2]、子宫颈癌[3-5]、头部和颈部癌[6-8]、胶质瘤[9-10]、前列腺癌[11]与皮肤鳞状细胞癌等[12]均有异常表达，与肿瘤的形成及多药耐药密切相关。近年来，RNAi技术的出现，给人类治疗癌症带来巨大福音，可用来研究与癌症相关基因的变化机制，成为可代替临床治疗，改变多药耐药机制的一种新方法。双链核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）经酶切后会形成很多小片段，称为小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）。siRNA 与信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）中的同源序列发生互补结合，导致mRNA失去功能，不能翻译产生蛋白质，使基因“沉默”。本研究中LRIG-1是治疗卵巢肿瘤的新靶点，在多种癌症中的siRNA沉默LRIG-1将为一种新的高选择性LRIGs开发提供可靠的科学依据。本研究在既往研究基础上，进一步探讨LRIG-1分子在卵巢癌及其耐药细胞株中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

卵巢浆液性囊腺癌（SKOV3）细胞株（北京大学人民医院），依托泊苷（VP16）（江苏省连云港市恒瑞医药股份有限公司），SKOV3/VP16（选取SKOV3以浓度为300μg/ml的VP16反复大剂量冲击用药，培养8个月建立VP16耐药细胞株，反复传代＞3个月），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国 Thermo Fisher Scientific公司，No：10099-141），高糖培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（美国Hyclone公司，No：SH30022.01B），青链霉素、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）及CCK-8试剂盒 （cell counting Kit-8）（日本 Dojindo，No：CK04），LipofectamineTM2000（美国 Thermo Fisher Scientific 公司，No：52887），Annexin V/PI apoptosis kit（浙江省杭州市联科生物公司，AP101），结晶紫染色液（自配），Trizol（日本TaKaRa株式会社），焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）（美国 Sigma公司），聚合酶链反应仪（丹麦DBI公司），逆转录试剂盒（DBI公司），RNasin（美国 Promega公司）。

1.2 实验仪器

紫外分光光度计（日本Shimodzu公司），SCR20B型冷冻离心机（日本Hitachi公司），低温高速离心机（德国Hermle公司），凝胶扫描系统（德国UVP公司），Stratagene Mx 3000P Quantitative RealTime PCR设备（美国Agilent公司），ABI9700PCR扩增仪（美国ABI公司），超净工作台（江苏省苏州净化设备公司），Anke/飞鸽TDL-80-2B低速离心机（上海安亭科学仪器厂），倒置显微镜（德国Motic公司），INC108型二氧化碳CO2细胞培养箱（德国Memmert公司），流式细胞仪和酶联免疫检测仪（美国BD，FACS Calibur Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 SKOV3和SKOV3/VP16细胞培养与计数

将SKOV3和SKOV3/VP16细胞株按常规方法培养于含10%的FBS及青霉素、链霉素的MEM（minimum essential medium）培养基中，在 37℃、5%CO2、恒温、饱和湿度条件下培养，将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，取出40 μl单细胞悬液，40 μl台盼蓝试剂吹打均匀，放置5 min，取20 μl计数，细胞计数板一共16个小格，合成4个大格，活细胞清晰可现，其中SKOV3呈梭型，SKOV3/VP16呈不规则多边形，算出4大格内的总细胞数。

1.4 siRNA LRIG1转染SKOV3和SKOV3/VP16细胞

①转染前1天，分别将100μl含有1×104个的SKOV3和SKOV3/VP16细胞加入培养基6孔内，令转染过程中细胞密度达到至少50%；②在25 μl的DMEM无血清无抗生素培养基中加入siRNA LRIG1/sh LRIG1，混匀；③在 25 μl的 DMEM 无血清无抗生素培养基中加入LipofectamineTM2000，混匀，室温放置5 min；④将稀释好的siRNA LRIG1/sh LRIG1和LipofectamineTM2000试剂混合，室温放置20 min，将50μl混合液放入内含50μl培养基和细胞的培养孔内，摇晃培养板；⑤把细胞培养板放在CO2培养箱内，孵育4 h，除去复合物，更换培养基，放入培养箱中；⑥转染0、24、48和72 h后，吸去培养液，按每1ml完全培养基加入100μl CCK-8混合，每孔加入100μl CCK-8混合液，将培养板放到培养箱内孵育1 h。

1.5 噻唑蓝比色法测定SKOV3细胞存活率

用96孔板接种细胞，24 h后进行转染，转染后再等待 6 h，加入 VP16，噻唑蓝比色法[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]法检测 SKOV3细胞、siRNA LRIG1转染SKOV3细胞、SKOV3/VP16细胞和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞在VP16浓度梯度下的存活率，检测各细胞在490 nm处的吸光值并计算其各自的半抑制浓度（50%inhibitory concentration，IC50）。

1.6 平板克隆形成

将SKOV3细胞、siRNA LRIG1转染SKOV3细胞、SKOV3/VP16细胞和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞每孔200个/2 ml接种于6孔板中，置于培养箱中培养10d，弃培养基，加入PBS洗涤细胞2次，每个孔内加入无水甲醇，室温静置并固定15 min，弃去固定液，加入1%结晶紫染液1ml，室温染色15min，计算克隆形成率，克隆形成率=克隆数面积/接种面积（100%）。

1.7 实时荧光定量聚合酶链反应检测SKOV3细胞、siRNA LRIG1转染SKOV3细胞、SKOV3/VP16细胞和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的LRIG1 mRNA的表达

1.7.1 RNA提取 ①收集适量细胞，加入1ml Trizol，震荡混匀室温放置5 min；②加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15s，静置 3min；③4℃、12000r/min 离心 10min，取上清转移到新EP管；④加入等体积异丙醇，混匀，静置20min；4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液；⑤用1 ml 75%DEPC酒精洗涤；⑥4℃、12 000 r/min离心5 min，弃去液体；⑦室温晾干后，加入30μl DEPC处理过的双蒸水（distillation-distillation H2O，ddH2O），溶解RNA，置入-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.7.2 逆转录 以1 μg总RNA视为模板，依照使用说明书内容，对逆转录反应体系加以配置，体系的总含量为20μl。将其合成为DNA第一链，依照下述内容，全面配置反应液：Primer Mix 1.0，RNA 1.0 μg，DEPC 10.0μl，水 1.0μl，共 11 μl。后将其放置到35℃环境中共计300 s，急速冷冻。依照以下体系配置出反应液：5 RT Buffer 4.0 μl；RT Enzyme Mix 1.0 μl，DEPC 11.0 μl，水 4.0μl，共 20 μl。分别在98℃预变性10 min和37℃变性60 min，合成互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）第一链，再经Sephacryl s2300离心柱离心2 min除去引物等杂质，可获得纯净cDNA分子。

1.7.3 实时荧光定量聚合酶反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测 qRTPCR 反应条件：94℃预变性 2 min，94℃变性 20 s，58℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，40 个循环，以 GAPDH为内参，通过2-△△CT方法进行相对定量分析LRIG1 mRNA的相对表达。GAPDH，正向引物：5'-TGTTCG TCATGGGTGTGAA-3'，反向引物：5'-ATGGCATGGA CTGTGGTCAT-3'。LRIG1 正向引物：5'-GACCCTTTCTGACCGACAA-3'，反向引物：5'-CGCTTTCCACGGC TCTTT-3'。

1.8 流式细胞术检测SKOV3细胞、siRNA LRIG1转染SKOV3细胞、SKOV3/VP16细胞和 siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞凋亡

①转染前1天将容量为2.5×105的细胞接种在2 ml 6孔培养基，确保密度达到50%～70%；②在250μl的DMEM无血清无抗生素培养基中加入质粒或siRNA，柔和混匀；③在250μl的DMEM无血清无抗生素培养基中加入LipofectamineTM2000，柔和混匀，室温放置5 min；④将稀释好的siRNA和LipofectamineTM2000混合，室温放置20 min，把siRNA/Lipofectamin混合物放到内含有细胞以及培养基的小孔内，混合；⑤把细胞培养板放在CO2培养箱内，孵育4 h，更换完全培养基并放入培养箱；⑥转染后48h，收集细胞进行后续检测；⑦用ddH2O将5×结合缓冲液（Binding Buffer）稀释为 1×Binding Buffer，每0.5 ml 1×Binding Buffer加入5μl Annexin V和10μl PI，配制Annexin V/PI染色工作液；⑧吸去培养板中的培养基，每孔用2 ml PBS轻轻润洗培养板内细胞，吸去PBS，每孔加0.5 ml 0.25%胰酶，孵育，镜下观察，当胞质回缩，细胞之间不再连接成片，吸去胰酶，加入2 ml PBS，制成单细胞悬液，移至流式管，1000r/min离心5min，弃上清液；⑨加入200μl Annexin V/PI染色工作液，重悬细胞；⑩避光孵育15 mim，上机检测。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度VP16干预SKOV3细胞的存活情况

VP16干预 SKOV3、siRNA LRIG1转染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的存活率及 IC50，0、5、10、20、40、80、100、120、180和 200μg/L的 VP16处理 SKOV3、siRNA LRIG1转 染 SKOV3、SKOV3/VP16和 siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞48 h的吸光值逐渐降低，呈剂量依 赖 关 系 ，IC50 分 别 为 62.90、115.49、156.50 和195.42 μg/L，siRNA LRIG1 转染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的耐药指数分别为1.8、2.5和3.1。见附表。

2.2 SKOV3、siRNA LRIG1 转染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞增殖情况

SKOV3、siRNALRIG1 转染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞进行平板克隆实验，克隆率分别为（0.03±0.02）%、（0.05±0.01）%、（0.10±0.03）%和（0.15±0.04）%，4 组细胞增殖差异有统计学意义（F=39.338，P=0.000），与SKOV3比较，siRNA LRIG1转染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增高（t=0.026，0.070和 0.125，P=0.042、0.000 和0.000），与 siRNA LRIG1转染 SKOV3 比较，SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增高（t=0.044和 0.099，P=0.001和 0.000），与SKOV3/VP16比较，siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增加（t=0.055，P=0.000）。见图1。

附表 VP16干预SKOV3、siRNA LRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的吸光值 （n=3）

图1 4组SKOV3/VP16细胞增殖情况

2.3 SKOV3、siRNA LRIG1 转染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞中LRIG1 mRNA的表达

SKOV3、siRNALRIG1 转染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的LRIG1 mRNA 分别为 1.05±0.15、0.93±0.16、0.53±0.09 和0.23±0.04，4组的LRIG1 mRNA表达有差异（F=63.095，P=0.000），与 SKOV3 比较，siRNA LRIG1 转染 SKOV3、SKOV3/VP16 和 siRNA LRIG1 转 染SKOV3/VP16细胞的LRIG1 mRNA降低（t=0.130、0.525 和 0.825，均 P=0.000），与 siRNA LRIG1 转染SKOV3比较，SKOV3/VP16和 siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的LRIG1 mRNA降低（t=0.395和 0.695，均 P=0.000），与 SKOV3/VP16 比较，siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的LRIG1 mRNA降低（t=0.300，P=0.000）。见图 2。

2.4 SKOV3、siRNA LRIG1 转染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞凋亡情况

4组的凋亡细胞比较，差异有统计学意义（F=230.046，P=0.000），与 siRNA LRIG1 转染 SKOV3 比较，SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16的凋亡细胞减少（t=12.350、35.506和44.412，均P=0.000），与 SKOV3/VP16 比较，siRNA LRIG1 转染SKOV3/VP16凋亡细胞减少（t=23.156和32.063，均P=0.000），与 SKOV3/VP16比较，siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16 凋亡细胞减少（t=8.906，P=0.000）。见图3。

图2 SKOV3、siRNA LRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞LRIG1 mRNA表达

图3 SKOV3、siRNA LRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞凋亡比较

3 讨论

LRIG1发现于10多年前，科学家们开始假设其是一个肿瘤抑制基因[12]。一系列实验和临床数据都支持这一最初假设。此后，越来越多的证据证明，LRIG1可以抑制细胞的正常增殖和分化。LRIG1的增殖抑制作用在包括人胚胎肾细胞[14]、前列腺癌细胞[14]、小鼠成纤维细胞角质形成细胞[15-16]、膀胱癌细胞[17]、乳腺癌细胞[1，18-19]、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤细胞[20-21]、非洲绿猴肾细胞[21]、鼻咽癌细胞[7]与肺癌细胞[22]在内一系列组织细胞。在分子水平上，LRIG1可以负性调节由致癌受体酪氨酸激酶介导的生长因子信号：LRIG1可诱导表皮生长因子受体（EGFR）家族成员EGFR、ERBB2、ErbB3 和 ErbB4 的泛素化[14-15]，从而破坏MET受体[18]，作用于RET受体并抑制RET和下游信号的磷酸化[23-24]。另一方面，在ErbB2阳性的肿瘤细胞系中，过表达ErbB2可以下调雌激素受体，从而抑制雌激素诱导的LRIG1转录[1，19]。

笔者研究发现，LRIG1 mRNA在SKOV3/VP16耐药细胞株中的表达低于野生型SKOV3细胞株，使用siRNA沉默的SKOV3和SKOV3/VP16细胞中的LRIG1 mRNA进一步降低，差异有统计学意义，与之相对的，给予不同浓度的VP16，siRNA LRIG1转染SKOV3细胞、SKOV3/VP16和 siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的IC50依次增高，克隆集落刺激增加和凋亡降低。本结果表明，LRIG1可以抑制卵巢癌细胞的增殖，将其沉默后，细胞增殖能力减弱而凋亡增加。该结论与既往研究基本吻合，该结果提示在卵巢癌的治疗中，可以通过增强LRIG1蛋白的表达而促进肿瘤细胞凋亡，提高卵巢癌细胞放化疗的敏感性。如临床应用天然化合物藤黄酸可用于抗癌，机制在于藤黄酸可以通过AMP激酶的活化而上调LRIG1在胶质瘤细胞中的表达，从而抑制该细胞的增殖[25]。

结合本研究结果，笔者认为，LRIG1影响SKOV3细胞对药物的敏感性，呈剂量相关特点，沉默细胞中的LRIG1后，可以抑制SKOV3细胞凋亡，增强卵巢癌细胞中LRIG1表达以提高卵巢癌细胞放化疗敏感性。

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Role and mechanism of LRIG1 in SKOV3,siRNALRIG1 KOV3,KOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP16*

Hua Yang1,Yuan Ye2,Sheng-jun Xiao3,Xiao-mei Lei1,Xiao-hong Luo4
(1.Department of Gynaecology,the Second Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541199,China;2.Department of Gynaecology,Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541001,China;3.Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541199,China;4.Department of Medical Records,Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541001,China)

ovarian cancer;drug resistance;leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains-1

Q344.14

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.001

1005-8982（2017）11-0001-07

2016-12-15

桂林市科学研究与技术开发计划项目（No：20130120-3）

叶元，Tel：13517738776

Abstract:ObjectiveTo investigate the role and possible mechanism of LRIG1 in SKOV3,siRNALRIG1 KOV3,KOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP16.MethodsThe cell proliferation of SKOV3,siRNALRIG1 KOV3,KOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP16 were detected by MMT at different concentrations of VP16,which had been con-cultured for 48 hours.Cell proliferation was detected by plate cloning.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.LRIG1 gene expression was detected by quantitative real-time PCR.ResultsIC50 of SKOV3,siRNALRIG1 KOV3,KOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP1 were 62.90 μg/L,115.49 μg/L,156.50 μg/L and 195.42 μg/L,respectively,with the drug resistance index of 1.8,2.5 and 3.1 respectively.Compared with SKOV3,the cloning rates had increased (the mean differences were 8.000,37.692 and 72.000,P＜0.05),the LRIG1 mRNA (the mean differences were 2.994,88.366 and 279.004,P＜0.05)and apoptotic cells(the mean difference were 48.942,63.485 83.659,P＜0.05)had decreased significantly in siRNALRIG1 KOV3,SKOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP16 cells.Compared with siRNALRIG1 KOV3,the cloning rates had increased(the mean differences were 25.000 and 58.824,P＜0.05),the LRIG1 mRNA(the mean differences were 47.478 and 180.147,P＜0.05)and apoptotic cells (the mean differences were 53.678 and 42.687,P＜0.05)had decreased in SKOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP16 cells (P＜0.05).Compared with SKOV3/VP16,the cloning rates had increased (the mean difference was 10.000,P＜0.05),the LRIG1 mRNA (the mean difference was 92.784,P＜0.05)and apoptotic cells (the mean difference was 37.625,P＜0.05)had decreased in siRNA LRIG1 KOV3/VP16 cells(P＜0.05).Conclusions The LRIG1 gene can affect drug sensitivity of SKOV3 for lower LRIG1 could decrease the apoptosis of cells.