丹参酮Ⅱa对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的病理影响

叶励超，黄玉婷

1.福建医科大学附属第二医院神经内科，福建泉州 362000；2.福建医科大学附属第二医院检验科，福建泉州 362000

丹参酮Ⅱa对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的病理影响

叶励超1，黄玉婷2

1.福建医科大学附属第二医院神经内科，福建泉州 362000；2.福建医科大学附属第二医院检验科，福建泉州 362000

目的 探究丹参酮Ⅱa对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的病理影响。方法 从泉州实验动物公司购买60只小鼠，健康C57BL/6雌性小鼠，8～13周龄，研究时间2016年1—3月，使用MOG35-55作为抗原免疫，建立EAE模型。将小鼠随机分成两组，每组30只，一组为对照组，小鼠发病后腹腔注射5%DMSO。另一组为观察组，腹腔注射丹参酮Ⅱa。分别观察0、10、20 d两组小鼠的病理状况。 结果 观察组小鼠，在治疗10、20 d的临床症状明显比对照组轻，观察组小鼠的轴索损失比对照组轻，观察组小鼠20 d时的髓鞘病理评分为（0.86±0.33）分，对照组评分为（1.98±0.65）分，观察组和对照组的病理评分异有统计学意义（P＜0.05），观察组小鼠20 d炎性细胞浸润评分（1.49±0.47）分比对照组（2.61±0.62）分低，两组数据差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 丹参酮Ⅱa能够减轻EAE小鼠炎症反应，髓鞘脱失和轴索损伤，改善临床症状。

丹参酮Ⅱa；脱髓鞘；炎性细胞浸润；实验性自身免疫性脑脊髓炎

多发性硬化症是由T细胞介导的中枢神经系统疾病，病理变化主要是炎性细胞浸润，以及脑白质的脱髓鞘病变。多发性硬化症多发于中青年群体中，发病后需要长期的药物治疗，当前主要的药物是免疫抑制剂类和激素类的药物，这些药物的不良反应比较大，而且不适合长期用药。寻找合适的药物治疗多发性硬化症十分重要和紧迫[1-2]。实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病机制和多发性硬化症相似，是公认的研究多发性硬化症的理想动物模型，能够为多发性硬化症的治疗提供研究的借鉴。丹参酮Ⅱa是我国传统中药丹参的主要生物活性成分，是一种脂溶性二萜醌类化合物，广泛应用于治疗心脑血管疾病等中，有多种药理作用，丹参酮Ⅱa对抑制脑损伤后的炎症反应有重要作用，能够保护脑和脊髓。为探究丹参酮Ⅱa对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的病理影响，特选取60只小鼠从2016年1—3月进行实验，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择60只健康小鼠，8～13周龄，小鼠全部雌性，质量180～200 g，将60只小鼠随机分为两组，观察组和对照组，每组30只，观察组小鼠周龄8～13周，平均周龄（10.3±1.7）周，体质量16～20 g，平均体质量（18.5±1.3）g，对照组小鼠周龄9～13周，平均周龄（10.5±1.4）周，体质量17～21 g，平均体质量（18.6±1.5）g，两组小鼠的周龄、体质量等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。观察组小鼠注射丹参酮Ⅱa，对照组注射5%二甲基亚砜（DMSO）。建立动物模型，对照组小鼠在神经功能评分达到1分后，每日腹腔注射5%DMSO，观察组在小鼠的神经功能评分达到1分后，开始腹腔注射丹参酮Ⅱa20 mg/kg，1次/d，直到处死。

1.2 方法

建立EAE模型，以MOG35-55为抗原免疫，免疫动物全部在乙醚麻醉的状态下，以及充分固定中进行。将抗原MOG35-55稀释成液体状态，使用生理盐水，达到5 mg/mL，然后加入完全弗氏佐剂，加入体积比例为1∶1，将液体混合均匀，乳化后，进行注射。每只小鼠0.1 mg，在脊柱两侧的皮肤下，分4点进行注射，免疫后当天为第0小时，从第 0～48小时，小鼠腹腔内注射 500 ng PTX，每只小鼠1 000 ng。每日早晨8：00和晚上16:00点，评估小鼠的临床症状，并对小鼠称重，在治疗前，治疗10，20 d，分别在观察组和对照组中取出10只小鼠，使用4%多聚甲醛灌注固定，取脊髓腰膨的大部分，制成石蜡切片，进行Bielschowsky's神经轴索染色观察、LFB染色观察和HE染色观察。

1.3 评价标准

小鼠的临床症状评分的标准为：四肢无异常为0分，步态不稳为1分，轻度瘫痪为2分，一个肢体全部瘫痪为3分，四肢全部瘫痪为12分；尾巴无异常为0分，尾巴半瘫为1分，尾巴全瘫为2分；死亡为15分。观察LFB染色标准的评分为无髓鞘脱失0分，轻度髓鞘脱失1分，中度髓鞘脱失2分，重度髓鞘脱失3分。HE染色评分为无炎症变化为0分，出现炎性细胞浸润但只在脊膜和血管周围为1分，轻度炎性细胞浸润为2分（1～10片），中度炎性细胞浸润为3分（11～100片），重度炎性细胞浸润为4分（100片以上）。每个组织每个切片随机挑选5个脊髓白质区域，观察“血管袖套”的形成情况，以及炎性细胞浸润情况，计算炎性细胞并取平均值。

1.4 统计方法

该次调查所有数据均采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析，计数资料用[n（%）]表示，用χ2检验进行计数资料间的检验，计量资料用（x±s）表示，用t检验，P＜0.05，为差异有统计学意义。

2 结果

60只小鼠在10～16 d内开始发病，表示EAE动物模型制作完成，能够对小鼠进行药物干预。对照组30只小鼠免疫后全部发病，小鼠的临床症状有体重减轻、缺乏食欲、行走困难、萎靡不振、皮毛粗糙等，发病高峰期临床症状最严重，小鼠双后肢，或者全部四肢出现肌力下降的现象，甚至大小便失禁、不能自主翻身、全部瘫痪，一些小鼠呈垂死状况，持续较长的时间。观察组30只小鼠免疫后也全部发病，在临床症状达到1分以上，开始进行药物治疗，对照组和观察组小鼠在治疗前，临床症状无显著差异。10 d后，对照组小鼠进入发病高峰期，临床症状严重，观察组小鼠给予丹参酮Ⅱa治疗，出现尾部瘫痪，或者双后肢轻度瘫痪或者全瘫，没有出现不能自主翻身，也没有大小便失禁，20 d后，对照组小鼠的症状有所缓解，但有后肢瘫痪或者尾部瘫痪的遗留症状，观察组小鼠症状缓解比较快，并且临床症状比较轻，只有尾部无力，或者尾部轻微瘫痪等症状。20 d时，观察组小鼠的神经功能评分为（1.32±0.17）分，对照组小鼠的神经功能评分为（2.51±0.39）分，（t= 7.832，P=0.002），对照组小鼠的神经功能评分高于观察组，两组数据差异有统计学意义（P＜0.05）。

通过对两组小鼠的Bielschowsky's神经轴索染色观察，治疗前，两组小鼠都存在轴索损伤，表现为肿胀扭曲、排列混乱和形状不规则。治疗10 d后，对照组小鼠轴索损伤更加明显，直径大小不一，形态不规则，病灶表现为大片状，轴索断裂，甚至消失，和髓鞘脱失、炎性细胞浸润的部位有一致性，而且和疾病的严重程度有密切的关系。观察组也存在轴索损失，但是程度和范围比对照组轻。治疗20 d后，对照组无明显变化，观察组比治疗10 d的损伤程度较轻。

通过两组小鼠的LFB染色观察，发病前两组小鼠没有明显的髓鞘脱失部位，但出现颜色变浅而且变薄的现象。对照组在10 d后，出现大小不同的片状髓鞘脱失区域，蓝色髓鞘部位减少，而且颜色变淡，甚至出现大片的空泡变性脱失区域，脱失部位常伴有炎性细胞浸润。治疗20 d后，没有明显变化。观察组小鼠在10 d后，存在小的髓鞘脱失区域，颜色变浅，部分髓鞘变薄，没有大片状脱失区域。治疗20 d后，比治疗10 d的髓鞘变粗，蓝色髓鞘区域增加。观察组20 d时，病理评分为（0.86±0.33）分，对照组评分为（1.98±0.65）分，（t= 6.475，P=0.001），观察组和对照组的病理评分差异有统计学意义（P＜0.05）。

通过两组小鼠HE染色观察，治疗前两组小鼠都存在炎性细胞浸润，集中在脊髓白质附近。对照组小鼠治疗10 d后，有大片状的炎性细胞浸润，脊髓多处小血管附近，小静脉4周，出现炎性细胞，主要是淋巴细胞，20 d后炎性细胞减少，血管袖套减少。观察组小鼠治疗10 d后，炎性细胞集中在小血管周围，很少有血管袖套现象，治疗20 d后，血管袖套现象完全消失，炎性细胞更加减少。两组病理评分差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组小鼠HE染色病理评分比较[(x±s)，分]

3 讨论

多发性硬化症的发病机制比较复杂，与细胞凋亡、异常的自身免疫反应激活有密切的关系，和EAE模型比较相似，主要是脱髓鞘反应和炎性细胞浸润等，EAE模型是国际公认的MS的动物模型[3-6]。该次实验通过建立EAE模型，探究丹参酮Ⅱa对EAE治疗的作用。实验小鼠在免疫后10～16 d开始发病，到大约20 d，对照组小鼠的平均临床评分达到最高。Bielschowsky's神经轴索染色表明，在疾病发生的早期，已经出现轴索损伤的现象，在高峰期更为明显。随着病情的恶化，轴索损伤逐渐加重，而且引起不可逆性的神经功能缺损。该次研究中观察Bielschowsky's染色，注射丹参酮Ⅱa的观察组，损伤程度明显比对照组轻，丹参酮Ⅱa对轴索损伤有保护作用。通过LFB染色观察和HE染色观察，观察组的髓鞘脱失病理评分为（0.86±0.33）分，对照组评分为（1.98±0.65）分，观察组明显低于对照组，观察组炎性细胞浸润病理评分（1.49±0.47）分，对照组（2.61± 0.62）分，观察组明显低于对照组，两组病理评分差异有统计学意义（P＜0.05）。有研究认为，丹参酮Ⅱa可以降低脊髓损伤后的一些炎性因子，降低炎性反应、氧化应激反应以及细胞凋亡，具有抗氧化、清除自由基、消炎、活血化瘀等作用，与该文研究结果一致[7-9]。丹参酮Ⅱa已被证实，具有良好的保护心肌的作用，是许多疾病的联合用药，并且可以促进损伤神经的修复，有保护神经的作用。

综上所述，丹参酮Ⅱa对于治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎有积极的作用，能够减少轴索损伤、髓鞘脱失和炎性反应，改善小鼠的临床症状。

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Pathological Effect of TanshinoneⅡa on the Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

YE Li-chao1,HUANG Yu-ting2

1.Departmentof Neurology,Second Affiliated Hospital of Fujian Medical College,Quanzhou,Fujian Province,362000 China；
2.Department of Clinical Laboratory,Second Affiliated Hospital of Fujian Medical College,Quanzhou,Fujian Province, 362000 China

ObjectiveTo study the pathological effect of tanshinoneⅡa on the mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.Methods60 healthy C57BL/6 female mice aged from 8 weeks to 13 weeks from January to March 2016 purchased by Quanzhou Experimental Animal Company were selected and MOG35-55 was used as the antigen immunity and the EAE model was established and the rats were randomly divided into two groups with 30 cases in each,the control group adopted the intraperitoneal injection of 5%DMSO after onset,while the observation group adopted the intraperitoneal injection of tanshinoneⅡa,and the pathological situations of the two groups was observed on 0 d,10 d and 20 d.ResultsThe clinical symptoms in the observation group at 10 d and 20 d were milder than those in the control group,and the axonal loss in the observation group was milder than that in the control group,and the medullary sheath pathological score in the observation group and in the control group was respectively （0.86±0.33）points and （1.98±0.65）points,and the difference in the pathological score between the two groups was obvious（P＜0.05）,and the 20 d inflammatory cell infiltration score in the observation group was lower than that in the control group[（1.49±0.47）points vs （2.61±0.62）points],and the difference was obvious with statistical significance（P＜0.05）.ConclusionThe tanshinoneⅡa can relieve the EAE mice inflammatory reactions,myelinoclasis and axonotmesis and improve the clinical symptoms.

TanshinoneⅡa;Demyelination;inflammatory cell infiltration;Experimental autoimmune encephalomyelitis

R4

A

1674-0742（2017）06（c）－0034-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.18.034

2017-03-25）

泉州市技术研究与开发项目（2015Z33）。

叶励超（1973-），男，福建南安人，硕士，主任医师，研究方向:神经免疫。