窒息对新生小鼠心肌β受体表达的影响

李昌健，席世兵，李涛

• 论著 •

窒息对新生小鼠心肌β受体表达的影响

李昌健1，席世兵1，李涛1

目的 探讨窒息对新生小鼠心肌β受体表达的影响及β 2受体激动剂的干预效果。方法 清洁级出生3 d的ICR小鼠108只，雌雄不限，采用随机数字表法分为：正常组（n=36）仅置于广口瓶中，未给予处理；窒息组（n=36）参照文献方法制备新生鼠常压窒息模型；干预组（n=36）处理同窒息组，但在窒息前2 h单次腹腔注射非诺特罗。干预后分别于小鼠出生后3、5、7、14、21、28 d随机从各组取6只，测定心电图，处死，计算心重指数（HW/BW）。留取心脏组织，免疫组化法和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测β1、β2受体表达。结果 正常小鼠心肌组织β1受体免疫组化染色，可见心肌细胞排列整齐，细胞核清晰，细胞膜完整，无炎性细胞浸润。细胞核膜及胞浆着色，随着小鼠日龄（3～28 d）增加，黄染逐渐变深。Western blot结果显示28 d小鼠心肌β1受体相对表达量明显高于3 d的小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）。β2受体主要为细胞核膜及胞浆着色，随着日龄增加，着色变浅，Western blot显示28 d小鼠心肌β2受体相对表达量明显低于3 d的小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组3 d小鼠比较，窒息处理后，小鼠心肌β1、β2受体免疫组化染色变浅，表达均明显下降，且窒息组心肌细胞排列紊乱，有少许炎性细胞渗出。Western blot结果显示，窒息组较正常组心肌β1、β2受体相对表达量降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与正常组28 d小鼠相比，干预组及窒息组小鼠心肌β1、β2受体相对表达量均降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。干预组28 d小鼠心肌β1、β2受体相对表达量相比于窒息组有升高趋势。28 d小鼠中，窒息组较正常组HW/BW升高，干预组较窒息组HW/BW降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论 未成熟心肌发育过程中，正常小鼠β1受体表达升高，β2受体表达下降，窒息会导致β1、β2受体表达均下降，而特异性β2受体激动剂非诺特罗预处理，可促进β1、β2受体表达恢复。

窒息；心肌细胞；β肾上腺素受体；β2肾上腺素受体激动剂

肾上腺素能系统在调节心血管的稳态上起重要作用。内源性的儿茶酚胺肾上腺素和去甲肾上腺素通过活化9种不同的肾上腺素受体亚型发挥调节作用，心肌细胞表达α受体（α1，α2）和β受体（β1，β2，β3），α受体具有正性肌力作用（效应明显小于β受体）。心脏β1受体的表达量约占70%～80%，β2受体的表达量约20%～30%，β3受体含量较少，主要存在于哺乳动物的脂肪组织和胃肠道。

不同物种不同生长环境，心肌细胞发育、成熟的时限不一致，早产儿、足月儿及婴幼儿心肌细胞称为未成熟心肌细胞[1]。未成熟心肌细胞β受体表型分布及功能均不同于成熟心肌细胞，主要表现为未成熟心肌细胞β2受体为主，介导心肌收缩[2]，而在成熟心肌细胞中，以β1受体为主，介导心肌收缩。成熟心肌细胞在心肌梗死或心力衰竭时，β1受体密度下调，其下调程度与疾病的严重程度明显相关，而β2受体密度并无明显变化[3]。未成熟心肌细胞缺氧损伤后，β受体分布是否发生变化，甚至影响发育过程。窒息是新生儿围产期严重并发症之一，对心脏、大脑、肾脏等重要器官均可造成损伤。目前窒息对新生儿心脏β受体影响的研究较少。本研究分析了窒息新生小鼠β受体及心脏功能变化，为临床上新生儿窒息心肌损伤治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 清洁级出生3 d的ICR小鼠108只，雌雄不限，体重2～4（2.99±0.42）g，由湖北医药学院动物中心提供。凝胶制备试剂盒、彩色Marker（碧云天公司），兔抗小鼠β1、β2抗体（博奥森公司），Anti-GAPDH、二抗pv-6000 山羊抗兔/小鼠聚合物（中杉金桥公司），氢溴酸非诺特罗标准溶液（阿拉丁公司）。

1.2 动物模型制备、分组以及处理 采用随机数字表法分为：对照组（CTL组，n=36）仅置于广口瓶中，未给予处理；窒息组（AS组，n=36）参照文献[4]方法制备新生鼠常压窒息模型，将新生小鼠置于磨口瓶中，内装0.005 kg钠石灰，待小鼠安静后，塞紧瓶塞，密闭30 min，立即吸氧120 min，放回笼中由母鼠哺乳饲养；干预组（FEN组，n=36）处理同窒息组，但在窒息前2 h单次腹腔注射非诺特罗（125 μ g/kg）。干预完，分别于小鼠出生后3、5、7、14、21、28 d随机从各组取6只，测定体重（BW），麻醉后行心电图检测，处死，开胸取心脏组织，去除大血管及心外膜脂肪组织，用预冷的PBS缓冲液清洗干净后滤纸吸干，称全心重量（HW），计算心重指数（HW/BW）。将部分心肌组织投入10%中性福尔马林液中固定，行病理组织学检测，部分心肌组织保存于-80℃冰箱，用于免疫蛋白印迹检测。

1.3 免疫组化检测小鼠心肌β受体表达 心脏组织经乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，石蜡切片（5 μ m）脱蜡至水。室温孵育，蒸馏水冲洗，PBS浸泡抗原修复，滴加一抗（肾上腺素β1受体浓度1：400，β2受体1：600，PBS为阴性对照），室温孵育1 h后于4 ℃过夜。PBS冲洗3次，滴加二抗，孵育60 min。再次冲洗后显色剂（DAB）显色3～15 min，自来水冲洗，复染，脱水，透明，封片，显微镜拍照。

1.4 蛋白免疫印记法检测小鼠心肌β受体表达 提取并测定蛋白浓度，制备电泳上样样品。制胶（12%分离胶，5%浓缩胶）后拔去梳子，按照顺序加入Marker和样品，浓缩胶恒压80 V，时间约30 min；分离胶恒压 120 V，时间约60 min。恒流200 mA，转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗（GAPDH浓度为1：5000，β1受体1：500，β2受体1：400），4 ℃过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入1：5000的二抗，室温孵育2 h。遮光配制化学发光液，在凝胶成像仪上显影。扫描仪扫描图像，图像处理软件定量分析目的条带，测定光密度值，目的条带与GAPDH光密度值之比为相对表达量。

1.5 统计学分析 所有数据用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常组小鼠心肌β受体表达变化 正常小鼠心肌组织β1受体免疫组化染色，可见心肌细胞排列整齐，细胞核清晰，细胞膜完整，无炎性细胞浸润，无心肌细胞水肿及坏死。细胞核膜及胞浆着色，随着小鼠日龄（3～28 d）增加，黄染逐渐变深（图1）。Western blot结果显示28 d小鼠心肌β1受体相对表达量明显高于3 d的小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。β 2受体主要为细胞核膜及胞浆着色，随着日龄增加，着色变浅（图3），Western blot显示28 d小鼠心肌β2受体相对表达量明显低于3 d的小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。以上提示，在小鼠心肌发育过程中，β1受体表达逐渐上调，β2受体表达逐渐下调。

2.2 窒息组小鼠心肌β受体表达变化 与正常组3 d小鼠比较，窒息处理后，心肌组织β1、β2受体免疫组化染色变浅，表达均明显下降，且窒息组心肌细胞排列紊乱，有少许炎性细胞渗出（图4）。Western blot结果显示，窒息组较正常组心肌β1、β2受体相对表达量降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）（图5）。提示，窒息导致心肌β1、β2受体表达明显下降。

图1 正常小鼠心肌β1受体表达变化（400×，免疫组化染色）

图2 正常小鼠心肌组织β1、β2受体相对表达量（n=6）

图3 正常小鼠心肌β2受体表达变化（400×，免疫组化染色）

图4 两组小鼠心肌β受体表达比较（CTL：正常组；AS：窒息组；400×，免疫组化染色）

图5 两组小鼠心肌组织β1、β2受体相对表达量（CTL：正常组；AS：窒息组；n=6）

2.3 干预组小鼠心肌β受体表达变化 与正常组28 d小鼠相比，干预组及窒息组小鼠心肌组织β1、β2受体相对表达量均降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。干预组28 d小鼠心肌组织β1、 β2受体相对表达量相比于窒息组有升高趋势，提示药物干预β1、β2受体表达有恢复趋势（图6）。28 d的小鼠中，窒息组较正常组HW/BW升高，干预组较窒息组HW/BW降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）（图7）；三组心率无明显变化，差异无统计学意义（P均＞0.05）（图8）。

3 讨论

本研究结果显示，出生3～28 d，正常小鼠β受体表达发生动态变化，β2受体下调，β1受体上调。未成熟心肌细胞表达以β2受体为主，随着心脏发育，β2受体下调，β1受体上调，直到成熟，以β1受体为主。而且成熟心肌细胞也存在着动态变化，有学者发现，老年人β2受体进一步下调[5]。未成熟心肌细胞、成熟心肌细胞甚至衰老心肌细胞中β受体均不断变化。

图6 三组小鼠心肌组织β1、β2受体相对表达量（CTL：正常组；AS：窒息组；FEN：干预组；n=6）

图7 三组小鼠HW/BW随时间变化（n=6）

图8 三组小鼠心率随时间变化（n=6）

同时选取新生3 d小鼠，窒息处理，结果显示，较正常小鼠，窒息小鼠心肌β1、β2受体下调。大部分学者在进行成年大鼠、小鼠心肌缺血缺氧损伤研究时发现，β1受体表达下调明显，而β2受体表达变化不明显。有学者培养的新生1～3 d小鼠心肌原代细胞，模拟心肌损伤后，发现β1、β2受体均下调[2]，新生1～3 d小鼠心肌属于未成熟心肌细胞，与本研究结果相似。目前认为成熟心肌细胞损伤后β1表达下调的原因，主要是成熟心肌细胞β1受体数量及功能均占主要地位，当心脏损伤时，内源性交感神经系统激活，导致β1受体减少，而内源性儿茶酚胺对β2受体选择性较低，因而下调不明显。而在未成熟心肌细胞中，以β2受体介导心肌收缩为主，损伤后，β2受体出现下调，而且较β1受体更明显。因此推测心肌细胞损伤后β受体变化与心肌细胞本身β受体表达量和功能相关。

由于本研究时间较短，存在以下不足之处：① 制备小鼠常压窒息模型后，由于采血困难，未进行血气分析及心肌酶检测，尚不能明确窒息时小鼠血氧变化及心肌酶学变化；② β受体异常是否导致心肌结构和功能异常尚未阐述清楚。

[1] 吴益平,陈道中. 未成熟心肌的特点及未成熟心肌保护的研究进展[J]. 湖南医学,2009,20(6):138-41.

[2] Leon LP,Srivastava S,Coetzee WA,et al. β 2-Adrenergic receptor agonists stimulate L-type calcium current independent of PKA in newborn rabbit ventricular myocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(5):2826-35.

[3] Bristow MR,Anderson FL,Port JD,et al. Differences in β-adrenergic neuroeffector mechanisms in ischemic versus idiopathic dilated cardiomyopathy[J]. Circulation,1991,84(3):1024-39.

[4] XU Shu-zhen,WANG Cai-xia,ZHAO Wei,et al. Influence of Matrix Met-alloproteinase on myocardial Remodeling in Neonatal rats after Asphyxia[J]. Journal of Applied Clinical Pediatrics, 2006,21(18):1214-6.

[5] Khan m,Mohsin s,Avitabile D,et al. β-Adrenergic Regulation of Cardiac Progenitor Cell Death Versus Survival and Proliferation[J]. Circ Res,2013,112(3):476-86.

本文编辑：姚雪莉

Influence of asphyxia on myocardial β-adrenergic receptor in neonatal mice

Li Changjian*, Xi Shibing, Li Tao.*Children's Medical Center, Taihe Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China.

Li Tao, E-mail: 317371983@qq.com

Objective To investigate the influence of asphyxia on expression of myocardial β-adrenergic receptor and interventional effect on β2-adrenoceptor agonist in neonatal mice. Methods Clean ICR mice (n=108, male or female) born for 3 d were randomly divided into normal group put into wide-mouth bottle without any treatment, asphyxia group prepared to ordinary pressure asphyxia model according to literature method, and intervention group given intraperitoneal injection of fenoterol 2 h before asphyxia (each n=36). The mice (n=6) were randomly chosen from each group on the 3rd d, 5th d, 7th d, 14th d, 21st d and 28th d for detecting electrocardiogram (ECG) and calculating heart weight index (HW/BW). The samples of cardiac tissue were collected for detecting the expressions of β1-adrenergic receptor and β2-adrenergic receptor by using immunohistochemistry technique and Western blot. Results The results of immunohistochemistry staining of β1-adrenergic receptor in normal mice showed that alignment myocardial cells, distinct nucleus and intact cell membrane without inflammatory cell infiltration. The staining of cell nuclear envelope and plasma darkened as the age of mice increased (from 3 d to 28 d). The results of Western blot showed that relative expression of β1-adrenergic receptor was significantly higher in 28-d mice than that in 3-d mice (P<0.05). The staining of β2-adrenergic receptor showed that staining of cell nuclear envelope and plasma became shallow as the age of mice increased. The results of Western blot showed that relative expression of β2-adrenergic receptor was significantly lower in 28 d mice than that in 3 d mice (P<0.05). The staining of β1-adrenergic receptor and β2-adrenergic receptor became shallow, and expressions of them decreased significantly in asphyxia group compared with normal group on the 3rd d, and there were malalignment myocardial cells and a few exudate inflammatory cells observed in asphyxia group. The results of Western blot showed that relative expressions of β1-adrenergic receptor and β2-adrenergic receptor decreased in asphyxia group compared with normal group (all P<0.05). The relative expressionsof β 1-adrenergic receptor and β 2-adrenergic receptor decreased in intervention group and asphyxia group compared with normal group on the 28th d (all P<0.05). The relative expressions of β1-adrenergic receptor and β 2-adrenergic receptor had an ascending trend in intervention group compared with asphyxia group on the 28th d. HW/BW increased in asphyxia group compared with normal group, and decreased in intervention group compared with asphyxia group on the 28th d (all P<0.05). Conclusion In the development of immature myocardial cells, the expression of β1-adrenergic receptor increases and expression of β2-adrenergic receptor decreases in normal mice. Asphyxia will induce the decreases of expressions of β1-adrenergic receptor and β2-adrenergic receptor, and fenoterol pretreatment to specific β2-adrenoceptor agonist will improve the recovery of expressions of β1-adrenergic receptor and β2-adrenergic receptor.

Asphyxia; Myocardial cells; β-adrenergic receptor; β2-adrenoceptor agonist

R4

A

1674-4055(2017)07-0800-04

湖北省卫生计生科研基金(WJ2017M219)

1442000 十堰,湖北医药学院附属太和医院儿童医疗中心

李涛,E-mail:317371983@qq.com doi：10.3969/j.issn.1674-4055.2017.07.08