D—900阴离子交换树脂纯化救必应中紫丁香苷工艺研究

2017-08-26张俏史文静杜文娟

中国医药导报 2017年19期

张俏　史文静　杜文娟

[摘要] 目的研究D-900阴离子交换树脂对救必应中紫丁香苷的纯化工艺。方法采用高效液相色谱法和紫外分光光度法，以紫丁香苷保留率和溶液脱色率为指标，对树脂纯化条件进行考察。结果 D-900阴离子交换树脂纯化最佳工艺为树脂重量和样品体积比为1∶5，树脂柱径高比为1∶5，上柱流速为2 BV/h，在此条件下紫丁香苷保留率达80%以上，溶液脱色率达30%以上。结论紫丁香苷粗分离液通过树脂纯化的工艺，简单易行。

[关键词] D-900阴离子交换树脂；救必应；紫丁香苷；纯化

[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（a）-0016-04

[Abstract] Objective To research the method for purification technology of syringin in Cortex Ilicis Rotundae by D-900 resin. Methods The purification conditions of the resin were investigated by high performance liquid chromatography and ultraviolet spectrophotometry. The retention rate of syringin and the decolorization rate of the solution were investigated. Results The purification parameters of D-900 resin was as following： resin weight and sample volume ratio of 1∶5， resin column diameter and high ratio of 1∶5， adsorption velocity of 2 BV/h. The retention rate of syringin was above 80% and the decolorization rate of the solution was above 30% under these conditions. Conclusion The purification technology of syringin is simple and feasible.

[Key words] D-900 resin； Cortex Ilicis Rotundae； Syringin； Purification

救必應又名白木香、白皮冬青、熊胆木等，为冬青科植物铁冬青（Ilex rotunda Thunb.）的干燥树皮[1]，始载于《岭南采药录》，称“白木香、味苦、清热毒”，其味苦，性寒，归肺、胃、大肠、肝经，具有清热解毒、利湿止痛等功效，常用于咽喉肿痛、风湿痹痛、湿疹等，《中国药典》（2015年版一部）收载了该药材。据文献报道，救必应中所含主要化学成分为黄酮苷、酚类、三萜苷等，大多具有清热解毒、消肿止痛的功效[2]。现代药理学研究结果表明，紫丁香苷、长梗冬青苷以及其总黄酮类、总皂苷类成分为救必应主要有效成分，此类成分在心血管疾病、内分泌系统疾病、抗炎抗肿瘤、免疫调节等方面表现出了极强的生理活性[3-12]。并且紫丁香苷和长梗冬青苷在救必应中含量很高，其中紫丁香苷在药典中的含量限度是同为药典收载品种的刺五加紫丁香苷含量限度的20倍，具有开发中药一类新药的资源优势[13-19]。

本实验采用D-900阴离子交换树脂对救必应中紫丁香苷的纯化工艺进行研究，通过对救必应中紫丁香苷粗分离液色素的静态吸附、动态吸附性能等因素进行考察[20-29]，以确定树脂脱色的最佳工艺参数，为救必应中紫丁香苷纯化研究提供参考。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

救必应药材（产地广西，购自陕西铎耀中药饮片有限公司，经陕西中药研究所赵新礼研究员鉴定）经检验均符合《中国药典》（2015年版）有关规定；紫丁香苷对照品（批号：111574-200603，供含量测定用，中国食品药品检定研究院）；D-900型大孔吸附树脂（批号：20140410，陕西蓝深特种树脂有限公司提供）；乙腈（色谱纯，Fisher scientific）；甲醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪（可变波长紫外检测器，美国安捷伦）；Cary50紫外分光光度计（美国瓦里安公司）；电子分析天平（AG-135、PB3002-S，梅特勒-托利多仪器有限公司）；KH3200SP超声波清洗机（昆山禾创超声仪器有限公司）；纯水器（美国Millipore）。

2 方法与结果

2.1 考察指标

2.1.1 紫丁香苷保留率在相应的色谱条件下检测紫丁香苷含量，通过样品中紫丁香苷含量的变化考察树脂的吸附效果。紫丁香苷保留率=样品脱色后紫丁香苷含量/样品脱色前紫丁香苷含量×100%。

2.1.2 脱色率将紫丁香苷粗分离液加水稀释25倍，在200～800 nm波长范围内对其进行光谱扫描，确定适合的检测波长，通过样品吸光度变化考察树脂的脱色效果[30]。脱色率=（样品脱色前溶液吸光度-样品脱色后溶液吸光度）/样品脱色前溶液吸光度×100%。

2.2 紫丁香苷含量测定

2.2.1 色谱条件色谱柱：kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相：乙腈-水（1∶9）[31]；检测波长265 nm；理论塔板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000。

2.2.2 对照品溶液的制备精密称取紫丁香苷对照品7.5 mg，置50 mL量瓶中，加入甲醇制成0.15 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 紫丁香苷粗分离液的制备取救必应药材2 kg，加30%乙醇10倍量，提取2次，每次1.5 h，提取液减压浓缩，干燥，粉碎，得救必应浸膏粉480 g，备用。取救必应浸膏粉300 g，加9000 mL热水充分搅拌，减压抽滤，取续滤液，经大孔吸附树脂吸附后，5%乙醇溶液除杂，30%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液（紫丁香苷含量1.614 mg/mL），即得。

2.2.4 供试品溶液制备及含量测定精密吸取样品溶液适量，加水稀释10倍，滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算紫丁香苷含量。

2.3 吸光度测定

取“2.2.4”项下供试品溶液加水稀释2.5倍，以相应的试剂为空白，采用紫外-可见分光光度法（《中国药典》2015年版四部通则0401），在已选择的波长处测定吸光度，即得。

2.4 樹脂的预处理

取D-900树脂适量，将其置于相当于被处理树脂体积2倍量的饱和食盐溶液中，浸泡20 h，放尽食盐水，用水漂洗干净（至排出水不带黄色）；然后将其置于5% HCl溶液中，浸泡6 h，放尽酸液，用水清洗至中性；最后将其置于3% NaOH溶液中，浸泡6 h，放尽碱液，用水清洗至中性，备用。

2.5 紫丁香苷粗分离液色素的脱色考察

2.5.1 D-900树脂对紫丁香苷粗分离液色素的静态吸附试验精确称取预处理好的树脂2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g，置于锥形瓶中，分别精密加入25 mL紫丁香苷粗分离液，振荡4 h后，过滤，取滤液置于250 mL量瓶，加水定容，测定其紫丁香苷含量。分别取该溶液20 mL加水定容至50 mL，测定该溶液脱色后的吸光度。分别计算紫丁香苷保留率和脱色率，结果见图1。

由图1可见，呈现出随着树脂用量增加，所得样品溶液脱色率逐渐升高、紫丁香苷保留率逐渐降低的趋势，为后续试验提供一定的依据，并希望通过进一步的研究寻求两指标的平衡点。

2.5.2 D-900树脂对紫丁香苷粗分离液色素的动态吸附试验将预处理好的树脂10 g以湿法装入层析柱中，紫丁香苷粗分离液以流速2 BV/h通过交换柱，收集流出液，每5毫升一份，加水定容至50 mL，测定其紫丁香苷含量，取该溶液20 mL加水定容至50 mL，测定溶液脱色后的吸光度。分别计算紫丁香苷保留率和脱色率，结果见图2。

由图2可见，D-900树脂动态吸附脱色率由100%逐渐降低，在第10号其趋势平稳，其后实验中脱色率无明显变化；紫丁香苷保留率逐渐升高，在第9号其趋势平稳，接近100%。综合考虑，确定D-900树脂在该条件下上样量为50 mL。

2.5.3 树脂径高比考察将预处理好的树脂以湿法装入层析柱中，径高比分别为1∶3、1∶5、1∶8、1∶10、1∶15，各加入一定量的紫丁香苷粗分离液，以流速2 BV/h通过树脂交换柱，具体见表1。分别收集流出液加水定容，测定其紫丁香苷含量。精密吸取该溶液20 mL，加水定容至50 mL，测定溶液脱色后的吸光度，分别计算紫丁香苷保留率和脱色率，结果见图3。

由图3可见，随径高比的增加，脱色率小幅提升，保留率略有下降。因此，依据数据结果及常规生产条件，确定D-900树脂径高比一般为1∶5左右。

2.5.4 流速考察将预处理好的树脂10 g以湿法装入层析柱（柱内径1.6 cm）中，加入紫丁香苷粗分离液50 mL，分别以流速1、2、3、4 BV/h通过树脂交换柱，收集各柱流出液，并加水定容至500 mL，测定紫丁香苷含量。精密吸取该溶液20 mL，加水定容至50 mL，测定溶液脱色后的吸光度，分别计算紫丁香苷保留率和脱色率，结果见图4。

由图4可见，随着流速的加快，脱色率呈现下降趋势，紫丁香苷保留率略有升高。因此，依据数据结果及常规生产条件，确定上样液流速为2 BV/h。

2.6 工艺验证

将预处理好的树脂10 g以湿法装入层析柱（柱内径1.6 cm）中，平行3份，分别加入紫丁香苷粗分离液50 mL，以流速2 BV/h通过树脂交换柱，收集各柱流出液加水定容至500 mL，测定其紫丁香苷含量。精密吸取该溶液20 mL，加水定容至50 mL，测定溶液脱色后的吸光度，计算紫丁香苷保留率分别为83.92%、85.14%、85.56%，脱色率分别为33.93%、32.20%、35.30%。结果表明，采用D-900树脂纯化救必应中紫丁香苷的工艺重现性良好。

3 讨论

3.1 柱洗脱方法对比

D-900阴离子交换树脂主要用于天然药物及糖类食品的脱色精制，其最大优点是可在醇溶液的情况下直接上柱脱色，这样既可简化工序，又减少目标成分的损失。笔者曾对同种大孔树脂（制备粗分离液时所用）二次上柱分离和上D-900脱色柱的效果进行比较，虽然所得浓缩液中紫丁香苷含量相差不大，但二次上柱洗脱分离明显步骤复杂；其浓缩液仍呈棕褐色，而上脱色柱浓缩液呈深青色；从直接析出晶体的质量上，明显上脱色柱远高于二次上柱分离的效果，证明本实验采用D900树脂纯化救必应中紫丁香苷的工艺可行性强。

3.2 D-900树脂紫丁香苷解吸附

通过保留率数据可知，树脂柱上残余约15%的紫丁香苷，考虑加洗脱液解吸附，以保证产品收率。经对不同浓度乙醇溶液洗脱效果考察，最终确定3倍量30%乙醇溶液为最佳树脂残留紫丁香苷解吸附的洗脱液及体积。并经考察，将两部分洗脱液合并，可使浓缩液中紫丁香苷保留率高达98%以上，且脱色效果良好，浓缩液析晶稳定，考虑将该环节纳入纯化工艺。

3.3 树脂循环使用周期

D-900树脂具有再生效率高、洗脱效果好等特点。但随着树脂的反复使用，树脂的吸附性能会有所下降，通过对树脂循环使用次数考察，该树脂使用6个周期后，虽然脱色液中紫丁香苷含量不受影响，但其脱色效果下降了近40%，需要对树脂进行再生处理。

3.4 资源开发

救必应药材的原植物在我国南方各地区分布广泛，来源丰富，现已运用该药材研发出救必应胃痛片、腹可安片、复方救必应胶囊等多种中成药，但其有效部位尚未得到充分开发。目前紫丁香苷的分离纯化工艺仅能满足制备不同含量的有效部位及小剂量单体，并且普遍存在紫丁香苷的流失大、溶剂残留毒性大、纯化过程漫长、工艺复杂、成本较高等问题。为了克服上述现有技术的缺陷，本实验目的在于提供一种制备紫丁香苷的纯化方法，该方法操作简单、安全有效，制备的紫丁香苷收率大、纯度高，力求研制出工艺简单、适合工业大生产的紫丁香苷分离纯化工艺，并将其进一步开发利用。

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