高效液相色谱—柱后光化学衍生法测定大米粉中黄曲霉B1含量

2017-08-24李红梅朱聿元韩华

安徽农学通报 2017年15期

李红梅　朱聿元　韩华

摘要：该研究建立了高效液相色譜-柱后光化学衍生法测定大米粉中黄曲霉毒素B1含量的方法。色谱柱采用安捷伦C18柱（150mm×4.6mm，5μm），以甲醇[∶]水=40[∶]60为流动相，采用荧光检测器测定大米粉中黄曲霉毒素B1的含量。黄曲霉毒素B1的线性范围为5～100ng/mL，检出限为1ng/mL，平均加标回收率为94.6%，相对标准偏差0.74%。该方法简单、快速、准确、重现性好，适用于大米粉中黄曲霉毒素B1的定量分析。

关键词：黄曲霉毒素B1；高效液相色谱；柱后衍生；荧光检测器

中图分类号 TS272 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）15-0135-3

Abstract：A high performance liquid chromatography method for separation and determination of Aflatoxin B1 in rice meal was established. The analytical column was Agilent C18（150mm×4.6mm，5μm），the mobile phase was methanol-water（40∶60，V/V），the samples were determined by an fluorescence detector with post-column photochemical reaction. The calibration curves had good linearity in the range of 5～100ng /mL for Aflatoxin B1，the detection limit for Aflatoxin B1 was 1ng/mL，the average recoveries of RA were 94.6%（n=6，RSD=0.74%）.The method was a convenient，rapid and effective method for qualitatively analysis of Aflatoxin B1 in rice meal.

Key words：Aflatoxin B1；HPLC；Post-column derivatization；Fluorescence detector

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFTB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）[1-3]。黄曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品，且以南方高温、高湿地区受污染最为严重。黄曲霉毒素耐热，280℃才可裂解，故一般烹调加工温度下难以破坏。黄曲霉毒素B1是已知的化学物质中致癌性最强的一种。目前，文献报道的分离方法有层析法[4-5]、酶联免疫法[5-6]、液相色谱法[7-11]、液质联用法[12-17]等，其中高效液相色谱法由于具方法简便、准确等伏点而被广泛采用。但由于黄曲霉毒素B1的紫外最大吸收波长为365nm，前处理麻烦，而免疫亲和层析-柱后光化学衍生法能够定量准确，适用于食品中黄曲霉毒素B1含量的测定。因此，本研究应用高效液相色谱-柱后衍生法对大米粉中黄曲霉毒素B1含量的测定进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器黄曲霉毒素B1标准品（LGC公司）、大米粉（江苏省食品药品监督检验研究院提供）；乙腈（色谱纯），Tedia公司；实验用水，超纯水；黄曲霉毒素B1免疫亲和柱（美国beacon，3mL）。1200液相色谱-荧光检测器，安捷伦公司；光化学衍生器（华安麦科）；Synergy超纯水机，美国密理博公司；BSA224S电子天平，Sartorius公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件选择色谱柱：安捷伦C8柱（150mm×4.6mm，5μm），安捷伦C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇：水=40[∶]60；荧光，激发波长360nm，发射波长大于420nm；进样量10μL；流速0.8mL/min。色谱柱方面，实验选择了C8和C18 柱，因为这2种种柱子做黄曲霉毒素B1比较常见，是分析实验中常用柱子。实验中发现黄曲霉毒素B1在C8柱子中分离效果不好，只有在C18柱子上能够达到很好的分离。流动相的选择中，在甲醇[∶]水=40[∶]60时候，标准品达到很好的基线分离。

1.2.2 标准溶液配制准确称取黄曲霉毒素B1标准品10mg，用流动相溶解后定容至10mL容量瓶中，摇匀，该溶液作为标准储备溶液。准确移取上述溶液并且用流动相稀释定容为5，10，20，50，100ng/mL，经0.45μm滤膜过滤，取续滤液备用，作为标准品溶液。

1.2.3 大米粉样品制备准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及甲醇-水（7+3）至125.0mL，以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0mL滤液并加人30.0mL水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1～2次，至滤液澄清，备用。准确移取15.0mL样品提取液过美国beacon免疫亲和柱，1.0mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

2 结果与分析

2.1 线性关系的考察精密吸取AFTB1标准溶液10[μL]，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，以浓度（ng/mL）为横坐标，绘制标准曲线（图1），得到回归方程：y=0.776846x-0.530622，R2=0.99931。AFTB1在5～100ng/mL之间线性关系良好。并以信噪比等于3为标准，测得AFTB1的检出限为1ng/mL。

2.2 精密度试验精密吸取AFTB1标准品溶液10[μL]重复进样6次，记录色谱图峰面积，并测定峰面积的平均值和相对标准偏差，测定结果见表1。连续6次实验结果显示，精密度实验相对标准偏差为1.45%，本实验测定AFTB1精密度良好，具有良好的准确度。

2.4 回收率实验精密称取样品约25g，精密加入AFTB1约3.5mg，按照1.2.3大米粉样品制备样品溶液，供液相色谱进行AFTB1分析，外标法定量。测定结果见表3。由表3中可知，回收率在93.5%～96.2%，平均回收率为94.6%，表明高效液相色谱-柱后衍生法检测大米粉中AFTB1含量具有良好的准确性。

2.5 样品测定取6批样品按1.3.3方法制备样品溶液，精密吸取样品供试液10μL，AFTB1标准溶液10μL，分别注入高效液相色谱仪，以外标法计算含量，见表4，样品中AFTB1含量都在20.046以上，相对标准偏差为0.74%。AFTB1标准品及样品的HPLC色谱图见图2、图3，从图2和图3可知，通过上述条件标准品和样品都能够达到很好的基线分离，出峰时间在7.159min左右，结果令人满意。

3 结论

本文采用高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定大米粉中黄曲霉毒素B1含量，对实验条件进行了优化，采用安捷伦C18柱（150mm×4.6mm，5μm），以甲醇[∶]水=40[∶]60为流动相分离效果较好，并对该条件了进行了实验方法的考察和实际样品的测定，结果表明，该方法稳定、准确、快速，适用于大米粉中中黄曲霉毒素B1的含量测定。

参考文献

[1]马海华，孙楫周，甄彤，等.我国国家标准和行业标准中黄曲霉毒素测定方法综述[J].食品工业科技，2016（6）：360-366.

[2]王恒玲，喻理，李培武，等.二氧化硅-氧化石墨烯復合物固相萃取-高效液相色谱法检测植物油中黄曲霉毒素 B1、B2[J].分析化学研究学报，2014，42（9）：1338-1342.

[3]苏建国，刘洋，赵燕，等.甜面酱中黄曲霉毒素B1、B2检测方法的研究[J].食品工业，2017，38（5）：304-306.

[4]高秀洁，邓中平，焦红，等.黄曲霉毒素B1快速检测方法的研究进展[J].热带医学杂志，2008，8（12）：1297-1300.

[5]柳其芳.酶联免疫吸附法和薄层色谱法联合分析黄曲霉毒素B1的研究[J].中国热带医学，2006，6（2）：246-248.

[6]董艾青，刘少文，柏凡，等.不同方法检测霉菌毒素的比较研究[J].中国饲料，2017（4）：27-30.

[7]黎睿，谢刚，王松雪.高效液相色谱法同时检测粮食中常见8种真菌毒素的含量[J].食品科学，2015，36（6）：206-210.

[8]冯靓，蔡增轩，谭莹，等.HPLC同时测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].中国卫生检验杂志，2007，17（3）：511-513.

[9]赵浩军，王坤，杨卫花，等.高效液相色谱柱后光化学反应-荧光检测茶叶中黄曲霉毒素B1[J].茶叶科学，2013，33（3）：237-241.

[10]郭金喜，远辉.超高效液相色谱法测定新疆巴旦木中黄曲霉毒素B1不确定度评定[J].酿酒科技，2017（5）：107-116

[11]胡佳薇，田丽，王敏娟，等.超高效液相色谱-大体积流通池荧光法检测食品中的4种黄曲霉毒素[J].中国卫生检验杂志，2017，27（8）：1109-1130.