猪沙门氏菌耐药基因检测方法应用分析

余超亚

摘要：沙门氏菌是一种重要的人畜共患病的病原菌，其分布广，危害大。而随着抗生素的广泛应用，细菌的耐药性也随之出现，耐药的水平越来越高，耐药种类越来越多。本文则针对猪沙门氏菌病的流行现状及危害，病原菌的耐药现状、耐药机理、耐药性的基因检测方法、防范对策进行综述。

关键词：猪；沙门氏菌；耐药机理；基因检测

在抗菌药物的不断普及以及广泛使用下，细菌逐渐呈现出耐药性。特别对于畜牧养殖业来说，为对疾病感染做出避免，使动物健康成长，越来越多的饲养人员将抗生素作为饲料添加剂来进行使用，因剂量不足以及药物残留使得耐药菌株大量出现。一直以来，各国学者针对细菌耐药机理实施了详细的探讨，取得了一定的成绩，尤其在分子生物学以及基因工程技术的不断快速发展下，细菌耐药机理实现了更深入的研究，本文则基于此对猪沙门氏菌耐药基因检测方法应用进行详细的分析。

一、猪沙门氏菌病的流行现状与危害

猪沙门氏菌会导致仔猪副伤寒，急性病例可能会引发败血症变化，有着极高的死亡率。慢性病例则可能会引发坏死性肠炎，对猪的正常生长造成不利影响。猪沙门氏菌极易引发2-4月龄仔猪副伤寒，属于养殖业面临的一大难题。急性败血症、慢性坏死性肠炎以及顽固性下痢等属于仔猪副伤寒（简称仔副）的临床症状，会导致大量的断奶仔猪同时发病，在并发感染其它疾病以及未及时治疗的情况下，有着极高的死亡率，使得养殖户出现很大的损失。该病随时有可能发生，通常都是和猪瘟同时出现，使得发病率以及死亡率出现了很大的增长。

二、病原菌的耐药现状及耐药机理

（一）病原菌的耐药现状

马越针对分离的沙门氏菌在耐药性变化方面实施了详细的研究探讨，得知非伤寒沙门氏菌在两年的时间里，对于临床常用抗菌药所具备的耐药率持续上升，自20.0%增长到了31.5%，一直增长至50.0%-59.3%，在耐药率方面出现了一倍左右的增长。基于国外相关调查能够得知，非伤寒沙门菌以及大肠杆菌对于临床常用抗菌药存在一定的耐药性，同时耐药率还处于不断增加的趋势，可以对多种抗菌药物产生耐药性的菌株数量也不断增加。通过CDC的资料能够得知，对于耐氨节西林，氯霉素，链霉素，磺胺以及四环素的鼠伤寒沙门菌，其从1979年占据美国鼠伤寒沙门菌分离株比重的l%以下朝1996年占据34%的比重进行了增长。最近几年，沙门氏菌多重耐药菌株持续导致人和动物出现疾病，对于公众健康有着极大的不利影响，使得世界各国对其做出了重视。

（二）病原菌的耐药机理

1.细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药机理

当前，比较常见的氨基糖苷类抗生素耐药机理主要包含有以下几种：其一，细菌之所以对氨基糖苷类抗生素存在抗性主要是因为药物无法在细菌胞内形成一定程度的浓度。细菌便是基于该机制而对庆大霉素存在耐药性的。其二，处于核糖体结合位点的变化核糖体属于氨基糖苷類抗生素的主要作用点，在核糖体蛋白以及16SrRNA出现突变的情况下，16SrRNA甲基化修饰等会使得细菌出现一定的耐药性。其三，细菌之所以可以对氨基糖苷类抗生素做出抵抗主要是由于细菌可以对氨基糖苷类抗生素钝化酶做出构成，该类酶共价对抗生素特定氨基以及氨基功能团起到修饰作用，抗生素以及核糖体氨酰-tRNA在被修饰之后，亲和力便会出现很大程度的减少，无法对细菌蛋白质在合成方面做出有效阻止，使得细菌对抗生素出现抵抗能力。

2.细菌对四环素类抗生素的耐药机理

通常情况下，四环素之所以存在耐药性主要是因为具备和接合质粒以及转座子相关的新四环素耐药基因tet（又叫做四环素抗性决定子）。tet基因编码胞质（浆）膜蛋白Tet（又叫做Tet逆向转运蛋白），属于质子动力依赖性蛋白的一种。Tet膜蛋白介导在耐药机制方面主要涉及到以下几个方面：能量依赖性泵出机制（又叫做主动转运机制）、核糖体保护机制以及四环素钝化酶机制。和核糖体保护机制存在关联的耐药基因主要包含有tet（M），tet（O），tet（S），tet（W），tet（Q），tet（T），otr（A）以及tetP（B）等这几种。和酶钝化机制存在关联的耐药基因主要包含有tetX编码蛋白，其属于氧化还原酶的一种，基于化学修饰四环素来让四环素不再具备活性。

3.细菌对磺胺类抗生素的耐药机理

当前，在革兰氏阴性肠道菌中，已发现对磺胺类药物存在抗性的两种二氢叶酸合成酶，Sul I，Sul II以及Sul III分别为其基因命名。相比大肠杆菌以及其它细菌中所包含的二氢叶酸合成酶基因（dhps）来说，Sul I，Sul II在保守序列方面存在很大的不同。而对于Sul III，对其的研究和探讨时间不长。2002年，Vincent等在对大肠杆菌的PV0440质粒进行研究的过程中，得知在质粒上存在一种功能和二氢叶酸合成酶十分相似的蛋白质，相当于263个氨基酸的大小。其表达基因Sul III可以让大肠杆菌对磺胺类药具备一定的抗性。

细菌之所以极易对磺胺类药物出现耐药性，主要是由于细菌中具备大量的PABA、二氢叶酸合成酶在结构上出现了更改以及对外源性叶酸进行了直接形式的使用。每种磺胺类药相互之间都会出现交叉耐药现象。

4.细菌对氯霉素类抗生素的耐药机理

一般情况下，酶的灭活机制细菌之所以对氯霉素以及甲砜霉素存在抗性主要是因为乙酰基转移酶对氯霉素以及甲砜霉素存在一定的钝化作用。黄瑞等针对伤寒沙门氏菌在耐药性方面实施了长期的研究，基于质粒的消除以及转化试验得知，该质粒是使得伤寒沙门氏菌具备耐药性的关键因子。孙宪锋以氯霉素乙酰转移酶活性（CAT）以及药敏试验（MIC）为基础，基于Slot blot以及Southern blot法对沙门菌耐药基因在位置方面实施检测，最终得知，大多数（10/16）伤寒菌耐氯霉素基因都存在于质粒上，还有一小部分（1/16）则存在于染色体（3/16）上。

三、耐药性的基因检测方法

（一）药敏试验

主要包含有两种方面，分别为稀释法以及扩散法。稀释法主要是基于大肠杆菌ATCC25922以及沙门氏菌标准株C79213来充当作药敏质控菌，通过对具备一定浓度的抗菌药物以及含有被试猪沙门氏菌的培养基做出运用来完成倍数上存在差异的稀释，通过一段时间的培养，对最低抑菌浓度（MIC）做出观察；扩散法主要指的是将浸有抗菌药物的纸片朝涂有猪沙门氏菌的琼脂平板上进行粘贴，抗菌药物不断向周围弥漫，浓度随着时间的推移慢慢减少，所以敏感猪沙门氏菌通常在纸片距离内会难以实现快速增长，基于稀释试验所获取的MIC对数和基于扩散试验所获取的抑菌直径之间存在着一种直线关系。

（二）实时定量PCR检测

这属于对荧光染料做出使用来实现快速定量的一种检测方法，该方法主要是对两种经过特别设计的序列特异性寡核苷酸做出运用，基于荧光染料来对核苷酸进行标记，通过杂交之后，这2种荧光染料在定位上十分接近，以此来为能量转移提供便利，这种情况被称作为荧光共鸣能量转移。第1种染料主要是由于受到光释放二极管的影响，其能量会朝第2种染料上进行转移。在此之后，第2种染料会对长波的红色荧光做出相应的释放。

（三）利用DNA芯片检测

基因芯片技术主要包含有两种模式：其一为将靶DNA朝支持物上进行固定，这种方法和同时进行大量不同靶DNA的分析之间较为符合，其二为将大量探针分子朝支持物上进行固定，这种方法和对同一靶DNA实施不同探针序列的分析之间较为符合。主要是对DNA芯片技术做出采用，以细菌23rRNA基因序列信息以及耐药基因为基础，来将其充当作检靶基因，对基于猪沙门氏菌的寡核苷酸探针以及耐药基因探针的基因芯片做出详细的设计，以杂交反应为基础，来对致病菌以及其耐药基因做出最终检测。

六、防止耐药性产生的对策

基于以下方法对耐药性进行控制，能够使得耐药菌株数量减少。具体为：

（一）加强药政管理

对抗菌药物在审批标准方面实施严格的管理，在对药物进行审批的过程中需对其耐药性以及所存在的隐性影响做出考量，对兽用抗菌药和人用医疗药物进行分开放置；对抗菌药物在质量管理方面做出全面加强，尽量减少对抗菌药物的使用；除此之外，针对监测细菌耐药性的和机构做出专门的构建，以细菌耐药的发展现状及趋势作为基础，对抗菌药做出计划性的使用。

（二）规范用药

减少通过抗生素来对猪沙门氏菌病进行预防的次数，以疫苗免疫机制为基础对该病做出有效控制。在对猪沙门氏菌病实施治疗的过程中，首先需采取药敏试验，避免用低敏药物来实施治疗。另外，要基于适应症来对剂量以及疗程做出确定，对由于剂量过大而导致的药物浪费和毒性反应做出避免，避免因剂量不足而引发的病情延迁现象，减少慢性、复发以及耐药性发生的几率。

（三）新型抗菌药物的研究

针对沙门氏菌耐药性在获取途径以及耐药性产生机理方面实施详细的分析研究，对新的抗菌药物做出持续的开发，对干预措施做出制定来对耐药性的产生做出有效避免，从而对越来越严峻的沙门氏菌耐药性问题做出有效防治。

结合以上所描述的，滥用抗生素属于导致猪沙门氏菌具备耐药性的主要影响因素，但耐药基因的遗传也属于其中一个原因。根据相关资料得知，通常情况下，其耐药性都是针对西药的，而对于中药则不明显，由此能够得知，在对猪沙门氏菌病做出治疗时，需对中药做出使用，若对西药做出使用则需先进行药敏试验，通过高敏药物来实施治疗。

结论

猪沙门氏菌具备分布广，危害大，传播速度快以及耐药性强等一系列特征，对于我国猪养殖业的发展造成了极大程度的影响。本文针对猪沙门氏菌的流行现状与危害、耐药机理以及耐药性的基因检测方法进行了详细的分析探讨，得出当前猪沙门氏菌具备极强耐药性的结论，相关人员需尽快找到抑制猪沙门氏菌耐药性的对策和方法。

参考文献

[1]侯小刚，刘书亮，韩新锋，吴聪明. 四川部分地区猪肉产业链中沙门氏菌的分離及其鉴定[J]. 食品科学，2013，11：250-253.

[2]夏诗琪，徐超莲，刘道峰，郭琦，吴松松，赖卫华. 胶体金免疫层析法联检食品中5种典型沙门氏菌模型的建立和优化[J]. 食品科学，2014，22：154-158.

[3]郑秋月，赵彤彤，袁慕云，许龙岩，荣策，曹际娟. 实时荧光PCR检测食品中丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌[J]. 食品科技，2014，02：297-301.

[4]加春生，毛泽明，王晓楠，王俊峰，王龙，陈爽，葛兰云，徐世文. 猪沙门氏菌的分离鉴定及其耐药性分析[J]. 东北农业大学学报，2014，08：49-54+64.