流式细胞分析在动物学研究中的应用

梅丽+侯东敏+朱万龙+张海姬+谌立新+王政昆

摘要：指出了流式细胞分析（Flow cytometry， FCM）是运用流式细胞仪对液相中悬浮细胞或微粒进行研究的新兴技术。目前已广泛应用于生物学、医学等领域，它具有检测速度快、灵敏度高，且操作简便等特点。介绍了流式细胞仪的发展及其原理，阐述了流式细胞分析在动物学研究中的应用，包括在水生动物、哺乳动物以及动物病理学研究等方面的应用，并对其进行了总结与展望，为流式细胞分析的进一步发展提供参考，以期流式细胞仪在动物学研究中得到更好的发展。

关键词：流式细胞分析；流式细胞仪；动物学

中图分类号：Q95

文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2017）14-0163-05

1 引言

流式细胞分析是利用流式细胞仪对荧光分子标记的动植物细胞、细菌、病毒以及其中的DNA、RNA、各种蛋白或其它分子进行研究，也可用于研究塑料微球或其他悬浮于液体中的微粒，是对液相中的细胞或微粒进行参数快速分析和分选的技术[1]。流式细胞仪集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体[2]，灵敏度高、测量速度快、被测群体大且能进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量[3～5]。目前已广泛运用于医学、生物学、材料学等领域，特别是在医学及生物学领域得到较快的发展。在生物学中，流式细胞仪用于植物研究中较少，而在动物学中的应用相对较多。

2 流式细胞仪的发展及原理

1934年，Andrew Moldaran开始了流式细胞分析的第一步，他通过显微镜技术，发明了一个能让细胞通过毛细管，并能对细胞进行计数的仪器[1]。1953年，Parker和Hutcheon描述一种全血细胞计数器装置，成为了流式细胞仪的雏形[6]。1967年，Kamentsky和Melamed在此基础上设计了分选仪器，它能给注射器提供电刺激，从液流中找出目标细胞，再进行观察分析，这就是流式分选的雏形[1]。1969年，Marvin van Dilla报道了第一台荧光检测的流式细胞仪，它用氩离子激光作为光源，包括照射、电子检测以及液流系统[1]。后来，流式细胞仪朝着能检测和分选不同类型细胞的大型机以及功能越来越强大、系统稳定发展的小型机两个方向发展[1]。

流式细胞仪的原理：目前使用的流式细胞仪包括4个系统：液流系统、光学检测系统、电子控制系统以及分析系统[1]。具有分选功能的流式细胞仪还具有分选系统[7]。其原理是进行荧光染色的悬浮细胞或微粒在压力下，经鞘液包绕形成鞘流，依次进入流式照射室的检测点，氩离子激光照射细胞发出散射光和荧光，其信号强弱与细胞内待测组分含量成正比[1，6]。散射光和荧光被前向光电二极管和侧向90°方向的光电倍增管接收放大后转化成电信号，再经转换器形成数据文件，储存在计算机上，以备脱机后的数据处理和分析[7]。

流式细胞仪的分选原理：具有分选功能的流式细胞仪通过细胞分选器分离含有单细胞的液滴完成细胞分选检测。由喷嘴喷射出的液流柱经高频的压电晶体产生高频振荡，斷裂形成均匀的液滴，根据选定的参数判明是否将被分选，而后对选定的细胞液滴充上正或负电荷，当带电液滴通过静电场发生偏转，后落入收集器中，通过不同孔径的喷孔及液流速度，实现细胞分选[6，8]。

3 流式细胞分析在动物学中的应用

近年来，随着生物学研究的深入，流式细胞分析作为一种重要辅助研究的方法被广泛应用于生物学领域，特别是动物学、细胞生物学等领域。

我国对流式细胞仪的研发起步较晚。1981年，北京师范大学生物系引进了国内第一台流式细胞仪[7]。此后，流式细胞分析不仅在科研领域，而且在临床医学等领域得到了较快的发展。

流式细胞分析最早用于细胞的分选以及血细胞的分类研究。1975年，Gray[9]首次运用流式细胞仪观察用DNA荧光染料染色的中国仓鼠（Cricetulus barabensis griseus）细胞中的染色体，根据染色体上染色含量的不同将单个染色体进行分拣。1984年，De Laat 和 Blass[10]首次报道了运用流式细胞分析识别和分拣植物染色体。国内最早的流式细胞分析应用是许秀芹，王宜艳[11]等学者，其利用流式细胞分析将海湾扇贝、虾夷扇贝、太平洋牡蛎等的血细胞分成透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞3个亚群。

3.1 流式细胞分析在水生动物中的应用

流式细胞分析早期应用于水生生物的研究中。沙爱龙[1]在Ashton-Alcox[12]与刘东武[13]等国内外学者应用流式细胞分析将美洲牡蛎、中国蛤蜊和紫石房蛤的血细胞分为3类的基础上，利用流式细胞仪将短蛸的血细胞分为大透明细胞、小透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞4种类型，他的研究表明与王晶[14]的活体染色方法相比，流式细胞分析更为方便可行，研究结果也更为精确。此外，沙爱龙[1]还概述了流式细胞分析在水生无脊椎动物细胞免疫学、染色体核型分析、无脊椎动物细胞核等方面的应用，并提出随着流式细胞仪的发展，它将会应用到无脊椎动物的生殖与遗传研究中，推动其分子细胞水平的研究。高如承[15]等就流式细胞分析在水生动物细胞分类、分选、细胞免疫功能、DNA研究以及精子质量评价方面进行了综述。流式细胞仪能快速、准确地量化大量单细胞的形态和功能，能更好地了解双壳类机体的免疫状况，从而保证养殖业更好地发展。Michael等在单细胞水平上利用荧光标记及流式细胞仪对美国东部的牡蛎防御机制进行了量化，结果发现颗粒细胞的吞噬活性和呼吸爆发活力最强，中间颗粒细胞次之，透明细胞无活性[15，16]。Helene Hegaret[17]等应用流式细胞分析对牡蛎血细胞的凝集、吞噬作用、生存能力以及呼吸爆发等功能在温度升高（20～28℃）前后进行研究，发现粒细胞具有较高的免疫性，有可能在免疫防御中起关键作用[18]。

应用流式细胞分析进行染色体核型分析是在1975年首次使用流式细胞仪的基础上逐渐发展起来的，与传统核型分析相比，它操作更为简单准确，且流式细胞分析还能对染色体进行纯化，得到克隆实验所要求的染色体，这是目前其他技术无法完成的[2]。测定细胞DNA含量时，用DNA特异性荧光染料对细胞核进行染色后，利用流式细胞仪进行检测，激光激发后，荧光强度与细胞DNA含量成正比，因此可得到被测细胞的DNA含量，从而可进行染色体倍性鉴定，但必须用已知DNA含量的细胞群体做参照[15，19]。

流式细胞分析还可用于生物精子质量评价，但其在水生生物精子评价中利用较少[20，21]。高如承[15]综述了国内外学者应用流式细胞分析评估水生动物精子的质膜完整性及线粒体活性的报道，但细胞凋亡方面未见报道，主要报道是对其它细胞的凋亡研究，流式细胞分析在此方面的应用多见于哺乳动物。

3.2 流式细胞分析在哺乳动物中的应用

流式细胞仪目前已成为生物研究中广为用之的仪器，它不仅能用于水生生物的血细胞分类、分选、细胞免疫机制、染色体核型分析等方面，而且在哺乳动物研究中的运用更为广泛。

3.2.1 分离哺乳动物的精子

人为地对精子类型进行选择，产生人类期望的性别后代，能促进畜牧业的发展。哺乳动物（家畜）中，有两条染色体，后代性别主要由父代的X/Y染色体决定，通常X精子的DNA含量比Y精子多3.0%～4.5%[22，23]。应用用流式细胞分析对哺乳动物的精子进行分离，可获得高纯度的X/Y精子群[24]，且分离速度快、准确性高。其原理是根据DNA含量的差异及所结合的荧光染料激发的荧光强度差别分辨出X、Y精子，利用流式细胞仪的分选原理，通过产生振荡，将液流断裂形成含X或含Y精子的均匀液滴，然后充上正（X精子）或负电荷（Y精子），经电场力的引导落入不同的收集器中，即可分离精子[24，25]。1989年首次采用了流式细胞分析分离了兔的XY精子，随后，这一技术逐渐应用于猪、牛、羊的精子分离[26]。高庆华[27]运用流式细胞术初步建立了山羊、梅花鹿和马鹿分选精液的低剂量受精技术体系且进一步采用扣除杂交筛选奶牛精液，初步获得牛XY精子间的差异表达基因。曲蕾[22]等综述了流式细胞分析在哺乳动物精子分离中的应用以及影响精子分离效率的因素，她指出染色液及流式细胞仪在分离时对精子活力有一定影响，所以应选择适当浓度的染色液。马利兵[26]等提出了流式细胞分析在分离哺乳动物的性别中的注意事项，表明对分离后的精子采用自然沉淀法进行浓缩可避免精子活力下降。

3.2.2 检测哺乳动物精液质量

通过精液质量检测测定精子的活力，在临床不孕症治疗及家畜繁殖中具有重要作用。利用流式细胞分析检测反映精子活性的多个指标，例如精子质膜完整性、顶体状态、染色质结构完整性等，测定精子的生育能力，这种方法适合自然状态下的精子检测，需结合荧光显微镜，与传统方法相互验证使用，其检测速度快，且便捷准确[28]。

3.2.3 流式细胞分析与细胞增殖、凋亡

何旦莎[30]等采用流式细胞仪对经特异性荧光染料染色不同年龄的大鼠脑组织的DNA进行含量的测定，结果表明，不同年龄不同部位的脑组织增殖程度不同，且同一部位的脑组织在不同年龄阶段，增殖情况也存在差异。

也可利用流式细胞分析对DNA含量、线粒体膜、Ca2+浓度进行检测，分析细胞凋亡情况[30]。王磊[31]等利用流式细胞分析对正常大鼠红细胞、老龄大鼠红细胞以及2型糖尿病大鼠红细胞进行研究，对比生理和病理两种情况对红细胞凋亡的影响，结果显示：糖尿病大鼠大量红细胞存在凋亡，且血液黏稠度增大，其他两类大鼠红细胞不存在凋亡。因此，可以看出红细胞凋亡与年龄无关，而与血液黏度有关。同样，也可利用流式细胞分析显示DNA含量直方图，分析细胞周期，但它只能分辨出G0/G1期、S期、G2/M期细胞[32]。后来，覃吉超[33]等在Cyclin的时相性表达理论[34]基础上建立了Cyclin E+A/DNA 多参数FCM，实现了将细胞周期分为6个时期的细胞群体，尤其是促进了G1期的进一步研究。

3.3 流式细胞仪在动物病理学研究中的应用

3.3.1 在动物免疫疾病中的应用

对CD抗原的分析可以反映淋巴细胞的分型和机体的免疫状态[35]。淋巴细胞可分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等几类[36，37]。根据CD3、CD19在T、B淋巴细胞上的作用，以及CD19在B淋巴细胞分化为成熟的浆细胞之后会丢失，可利用流式细胞分析检测淋巴细胞表面的CD3和CD19，从而计算淋巴组织中T、B细胞的含量[38]。外周血T淋巴细胞亚群（CD+4/CD+8）在机体正常情况下比值是一定的，约2∶1，但是当机体细胞免疫力低下时会出现比例下降[25，35]。这可用于检测机体免疫疾病，例如，人体被HIV感染后，大量CD+4细胞被破坏，其比值小于1。但是当自身免疫功能亢奋时会引起如类风湿性关节炎等自身免疫疾病[35]。杨蕾芳[39]等利用流式细胞仪检测小鼠感染附红细胞后，在不同组不同时间段CD4、IL-17的表达变化，探讨Th17细胞发挥的免疫学功能。结果表明小鼠感染附红细胞后Th17细胞增多，因此推测Th17细胞可能在附红细胞体感染过程中发挥了一定的免疫调节。屈雪琪[40]等利用流式细胞仪检测不同方式处理以及不同保存时间的猪淋巴细胞，探讨其对T淋巴细胞亚群中CD3+、CD4+、CD8+亚群的影响。

3.3.2 流式细胞分析在巨噬细胞功能检测中的作用

巨噬细胞具有吞噬、清除及呈递抗原异物的生物学功能，属于免疫系统的重要成员，是维持机体的正常生理状态所必需的，其与许多重大疾病的发生和发展密切相关。

1982年，Steinkamp首创荧光微球流式细胞分析定量检测吞噬功能，目前，流式细胞分析在单核—巨噬细胞吞噬功能研究中得到广泛应用。黄琼[41]等利用流式细胞仪观察在不同处理温度、不同孵育时间下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球或荧光素标记大肠杆菌的能力，结果表明，在一定范围内，随着温度及孵育時间的延长，吞噬百分率会增大。流式细胞分析检测巨噬细胞吞噬能力较传统方法更准确，且快速、高效，可应用于评价保健食品对巨噬细胞吞噬功能的影响[41]。金齐力等[42]通过不同浓度荧光素标记结核分枝杆菌以及不同孵育时间的实验，建立流式细胞分析检测单核巨噬细胞吞噬荧光素标记结核分枝杆菌的方法，表明该方法简便、快速且重复性好。

3.3.3 流式细胞分析在血小板聚集功能检测与临床医学中的应用

2013年，国外学者报道了一种基于流式细胞分析检测血小板聚集率的新方法[43]。在此基础上，梅金平[44]等用CD61-PE和CD61-PITC标记经ADP、川芎嗪等处理后的小鼠血小板，通过流式细胞仪检测两种荧光染料的细胞群占所有血小板的百分比来评估血小板的聚集功能。结果显示，不同处理对小鼠血小板的影响不同。小鼠作为一种模式生物，与人类亲源性较高，基于流式细胞分析的小鼠血小板聚集活性检测方法，在临床医学上对血小板相关的基础研究以及抗血小板药物筛选平台具有借鉴价值。

流式细胞仪在临床医学中最早应用于肿瘤学中，通过对DNA含量变化的测定，对癌变过程作出判断，这利于癌前病变的有效措施，在以后的化疗过程以及预后评估等工作中也能起到指导作用[45～47]。流式细胞分析也可用于检测人体器官移植后的排斥反应，通常检测受体器官与供体器官二者血清中是否有相同的抗体或者检测移植后受体的免疫状态[48，49]。

4 总结与展望

流式细胞分析最早用于水生动物血细胞的分类及分选，之后在哺乳动物中得到广泛应用。本文综述了流式细胞分析在水生生物、哺乳动物以及在动物病理学中的应用。因流式细胞仪检测速度快、灵敏度高且能进行多参数测量，随着计算机技术的发展以及流式细胞分析的成熟，流式细胞仪不仅在生物学中取得良好发展，尤其在医学领域发挥着重要作用。生物学与医学是相辅相成的，生物学是医学的基础，尤其动物学与医学是密不可分的，其发展也将推动医学的进步。

流式细胞在生物学中的用途广泛，不但可以分拣染色体或根据检测DNA的含量而进行动物性别的选择以及细胞周期的检测，而且可以通过分析表面抗原检测机体的免疫情况，从而推测是否患病等。流式细胞分析在家禽中的应用较少，仅出现根据DNA含量不同，在出雏前对鸡胚性别鉴定的报道，后期可在家禽方面增加流式细胞分析的应用，用以发展经济。由于流式细胞仪所用荧光染料价格昂贵，且细胞悬液的制备过程、细胞荧光的染色程度、细胞流速的稳定性以及激光光源的稳定性等多种因素会影响检测结果[15]。因此，流式细胞术的研究可向价廉物美的荧光染料开发、细胞制备方法以及提高电子信号处理能力方向进行[15]。相信随着流式细胞分析的进一步发展，图像以及分析软件的研发，流式细胞仪会具有广阔的应用前景，在动物学研究中将会发挥更大的作用，进一步推动生物学领域的发展。

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