小鼠肺爆震伤后不同时间点超氧化物歧化酶-1、丙二醛-5及肌醇酶-α表达变化研究

张玉彪， 柳云恩， 佟昌慈， 丛培芳， 刘 颖， 史秀云， 施 琳， 金红旭， 侯明晓

沈阳军区总医院 急诊医学部 全军重症(战)创伤救治中心实验室 辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室，辽宁 沈阳 110016

·爆震伤·

小鼠肺爆震伤后不同时间点超氧化物歧化酶-1、丙二醛-5及肌醇酶-α表达变化研究

张玉彪， 柳云恩， 佟昌慈， 丛培芳， 刘 颖， 史秀云， 施 琳， 金红旭， 侯明晓

沈阳军区总医院 急诊医学部 全军重症(战)创伤救治中心实验室 辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室，辽宁 沈阳 110016

目的 探讨小鼠肺爆震伤后不同时间点超氧化物歧化酶(SOD)-1、丙二醛(MDA)-5及肌醇酶(IRE)-α表达的变化。方法 将64只小鼠分为空白对照组(8只)与爆震伤实验组(56只)。爆震伤模型建立后，分别于3、6、12、24、48 h与1、2周7个时间点解剖8只小鼠。观察每个时间点小鼠的呼吸与被毛状态等，应用RT-PCR与Western-blot检测小鼠肺组织SOD-1、MDA-5及IRE-α在基因与蛋白水平上的表达量。结果 爆震伤后，小鼠肺组织SOD-1表达在3 h后开始降低，1周后上升；MDA-5表达在3 h后开始上升，12 h时达到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表达在3 h后开始上升，24 h时达到最高，48 h后下降，2周时恢复正常。结论 小鼠肺组织在发生爆震伤3 h后开始出现氧化应激反应，12～48 h时氧化应激反应达到高峰，随后下降，到2周时基本恢复正常。

爆震伤； 小鼠； 肺； 氧化应激； 超氧化物歧化酶； 丙二醛； 肌醇酶

炸药、煤气罐、化学药品及水下爆炸等可瞬间产生并释放巨大的能量，产生一种超声速的冲击波，直接对机体造成损伤，这种损伤即爆震伤。冲击波产生后可形成负压，对肺产生一定的损伤，导致肺组织水肿与肺泡破裂，甚至血气胸，造成死亡[1-3]。本研究通过建立小鼠肺爆震伤模型，观察肺爆震伤后不同时间点反映氧化应激的指标分子与蛋白，探讨肺爆震伤后氧化应激反应的变化，为爆震伤初期的救治提供相关依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 C57小鼠64只，6～8周龄，雄性，体质量为23～25 g，由北京维通利华公司提供。反转录试剂盒购于日本TAKARA公司，荧光定量试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，蛋白提取试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司，BCA蛋白定量试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司，ECL显色试剂盒购于美国BIO-RAD公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)-1抗体、丙二醛(malondialdehyde，MDA)-5抗体及肌醇酶(inositol requiring enzyme，IRE)-α抗体购于美国Abcam公司，二抗抗体购于美国Abcam公司。

1.2 研究方法

将小鼠置于正常饲养房间进行饲养，正常饮食水，环境12 h昼夜交替，适应1周。将64只小鼠分为空白对照组(8只)与爆震伤实验组(56只)。空白对照组小鼠正常饲养；爆震伤实验组小鼠经0.55 MPa冲击波冲击，建立肺爆震伤模型后，分别于3、6、12、24、48 h及1、2周共7个时间点解剖8只小鼠。分别留取4只肺病理标本与4只肺冻存标本，将病理标本置于4%多聚甲醛固定后进行荧光染色，冻存标本置于-80℃冰箱待测基因与蛋白表达。1.2.1 生理学观察 观察两组小鼠被毛、饮食水、精神状态、体质量及呼吸的变化。

1.2.2 荧光染色法 将肺组织固定24 h后取材，然后脱水包埋切片与荧光染色。荧光染色按照试剂盒说明书进行。荧光显微镜下观察染色情况并拍片。

1.2.3 RT-PCR法 取肺组织标本，研钵内研磨，按照Trizol提取RNA步骤操作，对所提取的RNA进行定量，然后反转录为cDNA，SYBR Green实时荧光定量PCR，以GAPDH为内参，对GAPDH、SOD-1、MDA-5及IRE-α进行扩增并分析，计算小鼠基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western-blot法 匀浆机将肺组织制成匀浆，加入蛋白裂解液，以12 000 r/min速度离心5 min，吸取上清液，酶标仪制作标准曲线。然后蛋白质定量，垂直电泳，胶体内的蓝色条带至分离胶底部时，完成电泳。湿转法转印，加入GAPDH、SOD-1、MDA-5及IRE-α一抗，置于4℃过夜，加入二抗室温孵育，显影定影并拍照。以GAPDH为内参，进行灰度值分析，计算蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 生理学变化 空白对照组小鼠的饮食水等情况正常，体质量增长正常。爆震伤实验组小鼠爆震伤模型建立后呼吸急促，毛发无光泽，饮食水少于空白对照组，体质量增长慢于空白对照组，个别小鼠不增长；48 h后，爆震伤实验组小鼠呼吸等指标接近空白对照组；2周后，爆震伤实验组小鼠呼吸、毛发与空白对照组基本无差异。

2.2 荧光染色结果 爆震伤后，小鼠肺组织SOD-1表达在3 h后开始降低，1周后上升；MDA-5表达在3 h后开始上升，12 h时达到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表达在3 h后开始上升，24 h时达到最高，48 h后下降，2周时恢复正常。见图1。

2.3 RT-PCR结果 爆震伤后，小鼠肺组织SOD-1表达在3 h后开始降低，1周后上升；MDA-5表达在3 h后开始上升，12 h时达到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表达在3 h后开始上升，24 h时达到最高，48 h后下降，2周时恢复正常。与空白对照组小鼠比较，差异有统计学差异(P<0.05)。见图2。

图2 SOD-1、MDA-5及IRE-α基因相对表达量(与空白对照组比较，①P<0.05)

2.4 Western-blot结果 爆震伤后，小鼠肺组织SOD-1表达在3 h后开始降低，1周后上升；MDA-5表达在3 h后开始上升，12 h时达到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表达在3 h后开始上升，24 h时达到最高，48 h后下降，2周时恢复正常。与空白对照组小鼠比较，差异有统计学差异(P<0.05)。见图3。

图3 SOD-1、MDA-5及IRE-α蛋白相对表达量(与空白对照组比较，①P<0.05)

3 讨论

当爆炸波冲击机体时，部分震动被反射与衍射，部分被传播。反射压力高于入射压力，机体经受的机械负荷取决于反射压力，而不是入射压力[4-5]。爆炸冲击波可导致肺损伤，使肺上皮细胞通透性发生改变，出现血气胸或肺水肿等[6-10]。SOD-1能够清除机体新陈代谢过程中所产生的一些有害物质与自由基，在机体受到损伤时，SOD-1会自动调节以维护机体健康[11-13]。MDA为丙二醛膜脂过氧化的重要产物之一，而MDA-5是细胞膜内识别受体，自由基的产生与MDA有着很大的关系[14]。IRE-α作为细胞内质网上的感受蛋白，在发生氧化应激反应后，其可通过相关的蛋白促进细胞发生氧化应激而凋亡[12，15]。

本实验通过建立C57小鼠肺爆震伤模型，观察爆震伤后3、6、12、24、48 h与1、2周这7个时间点对小鼠生理学的影响及对肺氧化应激反应相关基因与蛋白的表达变化。小鼠爆震伤后，48 h内体质量相对降低，饮食水少于空白对照组，呼吸急促；不同时间点的荧光染色结果显示，爆震伤后，小鼠肺组织发生氧化应激反应，24～48 h时氧化应激反应达到高峰，随后下降，到2周时基本恢复正常，说明机体对外界的损伤具有一定的自我调节能力，可发挥保护作用；基因与蛋白检测的结果显示，爆震伤后，小鼠肺组织SOD-1表达在3 h后开始降低，1周后上升；MDA-5表达在3 h后开始上升，12 h时达到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表达在3 h后开始上升，24 h时达到最高，48 h后下降，2周时恢复正常，与荧光染色结果一致。

综上所述，小鼠肺组织在发生爆震伤3 h后开始出现氧化应激反应，12～48 h时氧化应激反应达到高峰，随后下降，到2周时基本恢复正常。因此，在爆震伤后，积极进行抗氧化应激等治疗，减少机体的氧化应激反应，对临床具有一定的指导意义。

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Changes of SOD-1,MDA-5 and IRE-α expression in the lungs of rats at different time points after blast injury

ZHANG Yu-biao,LIU Yun-en,TONG Chang-ci,CONG Pei-fang,LIU Ying,SHI Xiu-yun,SHI Lin,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao

(Emergency Medicine Department of General Hospital of Shenyang Military Command, Laboratory of Rescue Center of Severe Wound and Trauma PLA, Severe Trauma and Organ Protection key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110016, China)

Objective To investigate the changes of superoxide dismutase(SOD)-1,malonaldehyde(MDA)-5 and inositol enzyme(IRE)-α expression in rats at different time points after injury.Methods A total of 64 cases of rats were divided into the blank control group(n=8) and exploratory shock group(n=56).The model was established at 3 hours,6 hours,12 hours,24 hours,48 hours,1 week and 2 weeks on 8 rats.The respiratory and hair status of rats at each time point were observed.The expression of SOD-1,MDA-5 and IRE-α in lung tissue were detected by RT-PCR and Western-blot.Results The expression of SOD-1 began to reduce after 3 hours of blast injury,and increased after 1 week.The expression of MDA-5 increased after 3 hours,reached the peak after 12 hours and reduced after 24 hours,then once again increased after 1 week.The expression of IRE-α increased after 3 hours,reached the peak after 24 hours,reduced after 48 hours and returned to normal after 2 weeks.Conclusion Oxidative stress begins to occur after 3 hours of lung injury,and reaches the peak at 12～48 h,then reduces and returns to normal at 2 weeks.

Blast injury; Rats; Lung; Oxidative stress; Superoxide dismutase; Malonaldehyde; Alcoholase

全军十二五面上项目(CSY12J002)；全军重大新药创制项目(2013ZX09J13109-02B)；全军十二五面上项目(CSY13J002)； 总后卫生部重大新上(ASM14L008)

张玉彪(1987-)，男，黑龙江齐齐哈尔人，技师，博士

侯明晓，E-mail：houmingxiao188@163.com

2095-5561(2017)04-0193-05 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.04.01

2017-08-05