64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA:靶向叶酸受体阳性肿瘤的PET/MRI双模态显像探针

孙钰林，申一鸣，梁积新，陈玉清，沈浪涛,*

1.中国原子能科学研究院 国家同位素工程技术研究中心，北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413

64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA:靶向叶酸受体阳性肿瘤的PET/MRI双模态显像探针

孙钰林1,2，申一鸣1,2，梁积新1，陈玉清1,2，沈浪涛1,2,*

1.中国原子能科学研究院 国家同位素工程技术研究中心，北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413

报道了一种可用于叶酸受体阳性肿瘤显像的PET/MRI双模态显像探针(64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA)的合成、初步的生物学评价及PET/CT和MRI显像结果。该探针由包覆了生物相容性的聚乙二醇(poly ethylene glycol, PEG)、超顺磁氧化铁纳米粒子(superparamegnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs)、叶酸(folic acid, FA)、1，4，7，10-四乙酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid, DOTA)和正电子放射性核素64Cu组成。经纯化后，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA放化纯大于98%。荷KB裸鼠体内分布显示：64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在肝脏、脾脏和肺中的放射性摄取较高，与非靶向标记物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH比较，其对KB细胞瘤有明显的靶向作用。在MRI和PET/CT模式下，KB肿瘤能被较清晰地显像。64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA作为KB细胞肿瘤的PET/MRI双模态显像剂，有待于进一步深入研究以改善其标记率、稳定性和比活度等。

PET/MRI双模态显像探针；超顺磁性氧化铁纳米粒子；叶酸；DOTA；64Cu

近期的研究报告指出，2012年全球新增1 400万癌症病人并有820万病人死亡。其中，中国新增307万癌症病人并约有220万人死亡。癌症的早期诊断和有效治疗可以降低大约每年1/3至1/2(即240万～370万)癌症病人的死亡[1]。肿瘤早期诊断和靶向治疗药物的设计是利用各种肿瘤生物标志物(如特异性受体、单克隆抗体及其片段、多肽等)来实现的[2]。在许多肿瘤(如卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌和脑癌)中叶酸受体(folate receptor，FR)被过度表达。因此，叶酸受体是与这些肿瘤密切相关的靶标。人们已开展了以叶酸受体为靶向的各种肿瘤放射性显像药物的研究[3-4]。然而，无论是单光子发射计算机断层成像(SPECT)还是正电子发射断层成像(PET)的单模态显像技术，尽管它们具有高灵敏度等优点，但其空间分辨率较低。因此，融合了两种显像模态的SPECT/电子计算机断层扫描(CT)、PET/CT已在临床中得到了广泛应用。PET/磁共振成像(MRI)双模态显像技术既具有高灵敏度和高软组织对比度，而且与PET/CT相比，还显著降低了辐射剂量，已成为具有广阔应用前景的双模态医学影像技术。目前，全球约有70台PET/MRI已投入临床使用[5]。用于PET/MRI的双模态显像探针也正在研发中[6-8]。

PET/MRI双模态显像探针既要含有MRI成像组分，还要含有能用于PET显像的组分，还可能含有靶向分子。表面包覆有聚乙二醇(poly ethylene glycol, PEG)等聚合物的超顺磁氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs)本身既可以作为MRI造影剂，还可以作为构建双(或多)模态分子影像探针和其它生物医学应用的平台[9-10]。以叶酸受体为靶向的MRI肿瘤对比剂已有一些研究[11-13]，但其PET/MRI双模态显像探针鲜见报导。

本工作拟先合成表面接有3-氨基丙基三乙氧基硅烷的超顺磁氧化铁纳米粒子(SPIONs-APTES)；然后，把预先与叶酸偶联的聚乙二醇(FA-PEG)与SPIONs-APTES连接，得到SPIONs-PEG-FA；接着，再将能与正电子核素64Cu牢固结合的双功能螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid, DOTA)连接到SPIONs-PEG-FA上，获得DOTA-SPIONs-PEG-FA，进行核素64Cu标记后得到标记物(64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA)(图1)。最后分别用靶向探针64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA和非靶向探针64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH对荷KB细胞裸鼠进行体内生物分布以及PET和MRI显像的研究。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

N，N′-二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide, DCC)，上海沃凯化学试剂有限公司；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)，Alfa Aesar公司；氨基羧基聚乙二醇(NH2-PEG2000-COOH)，北京希凯创新科技有限公司；叶酸(folic acid, FA)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES)、二乙基三胺五乙酸(diethylene triamine pentacetate acid, DTPA)、醋酸铵及其它化学试剂均为分析纯，国药集团试剂有限公司；1,4,7,10-四乙酸-1,4,7,10-四氮杂环十二烷由本实验室制备；Whatman 1号层析纸、超滤浓缩离心管(Vivaspin 500, 10 kDa)，美国GE公司；透析袋(MWCO：8 000～14 000)，国药集团试剂有限公司；透析袋(MWCO：1 000)，佰聚生物；64CuCl2溶液由北京原子高科股份有限公司提供。

图1 64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA的结构示意图Fig.1 Structure of 64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA

荷KB人口腔表皮样癌细胞裸鼠，SPF级，中国医学科学院肿瘤研究所。取4～5周龄Balb/c雌性裸鼠，右前肢腋下接种5×106个KB细胞，待肿瘤平均直径达到8～10 mm时用于实验。

FD-80型真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；JEM2100F型透射电子显微镜、JMS-T100CS质谱仪，日本电子株式会社；Nano ZS动态光散射粒度分析仪，英国Malvern公司；Affinity-1傅里叶变换红外光谱仪、UV-2700紫外-可见吸收光谱仪，日本SHIMADAZU公司；BKT-4500Z型振动样品磁强计，美国Quantum Design公司；ADVANCE Ⅲ 400 MHz核磁共振波谱仪，德国Bruker公司；AR-2000放射性薄层扫描仪，德国Eckert Ziegler公司；1470-002 γ 计数器，美国Perkin Elmer公司；7.0 T小动物磁共振成像仪，美国Varian公司；Inveon 小动物PET/CT成像仪，德国Siemens公司。

1.2 纳米粒子的合成与表征

从超顺磁氧化铁纳米粒子核心的合成开始，经六步反应合成DOTA-SPIONs-PEG-FA，其反应路线示于图2。

1.2.1 SPIONs的制备 合成反应在N2保护下进行。将549 mg FeCl3·6H2O和282 mg FeSO4·7H2O溶于40 mL氮气饱和水中，搅拌溶解。滴加氨水将pH调至 9，再将温度升高到50 ℃，继续反应1 h。反应完毕后，用50 mL除氧水洗涤，磁铁吸附倾倒，除去铵盐，重复3次。产物在60 ℃下真空干燥，得到黑色块状固体SPIONs 123 mg(产率为53%)，于4 ℃下保存。

1.2.2 SPIONs-APTES的制备 移取0.5 mL氮气饱和水和10 mL无水乙醇混合，制备含水量为3%～5%(体积比)的水-乙醇混合溶液，并用冰醋酸调节pH 为4.5～5.5。然后，加入200 μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，活化5 min。再加入86 mg SPIONs，机械搅拌，反应过夜。反应结束后，以20 mL 95%乙醇洗涤，磁铁吸附倾倒，除去未反应的APTES，重复5次。产物在60 ℃下真空干燥，得到黑色粒状固体SPIONs-APTES 100 mg，于4 ℃下保存。

1.2.3 FA-NHS的合成 本反应在室温、N2保护和避光下进行。将502 mg 叶酸加入到10 mL无水二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌至溶解。再加入250 mg DCC反应2 h。将150 mg NHS溶于1 mL无水DMSO中，然后滴加到上述反应液中，5 min滴加完毕，在室温下反应过夜。将粗产物过滤除去沉淀，在40 ℃下将滤液减压浓缩30 min，再向滤液中滴加无水乙醚∶丙酮=7∶3(体积比，下同)的混合液，至不再生成沉淀为止。过滤，所得固体以50 mL无水乙醚∶丙酮=7∶3的混合液洗涤，重复3次，于30 ℃下真空干燥，获得黄色粒状固体FA-NHS 322 mg(产率为53%)，装瓶封口后在-20 ℃下保存。

1.2.4 FA-PEG的合成 在室温、N2保护下，将300 mg NH2-PEG-COOH加入到10 mL DMSO中，再将162 mg FA-NHS溶于2 mL DMSO中，滴加到上述反应液中，5 min滴加完毕，再加入150 mgN,N-二异丙基乙基胺，于避光条件下反应24 h。粗产物在去离子水中透析(截留分子量(MWCO)=1 000 Da)48 h后冻干，得到黄色泡沫状固体FA-PEG 267 mg(产率为76%)，装瓶封口后-20 ℃下保存。

图2 DOTA-SPIONs-PEG-FA的合成路线示意图Fig.2 Synthetic scheme of DOTA-SPIONs-PEG-FA

1.2.5 SPIONs-PEG-FA的制备 在N2保护下，将160 mg FA-PEG溶于20 mL无水DMSO中，加入84.8 mg EDC搅拌10 min，再加入24.8 mg NHS搅拌30 min。然后，将50 mg SPIONs-APTES溶于5 mL无水DMSO中，加入上述反应液中，反应过夜。反应结束后，经透析(MWCO=8 000～14 000)、冻干，得到黑色固体SPIONs-PEG-FA 169 mg，装瓶封口后在-20 ℃下保存。

1.2.6 DOTA-SPIONs-PEG-FA的制备 称取50 mg DOTA溶于5 mL水中，9.5 mg EDC溶于1 mL水中，将两者混合。用0.1 mol/L NaOH将pH值调至5，反应10 min。将反应瓶移至冰浴中，加入9 mg NHS，再用0.1 mol/L NaOH将pH值调至5.5，继续反应30 min。称取25 mg SPIONs-PEG-FA溶于3 mL水中，加入上述反应液中，再用0.1 mol/L NaOH将反应液pH值调至8.5，反应过夜。反应结束后，经透析(MWCO=8 000～14 000)、冻干，得到黑色固体DOTA-SPIONs-PEG-FA 28 mg，装瓶封口后在-20 ℃下保存。

1.2.7 纳米粒子的表征 采用傅里叶红外光谱仪(FTIR)测定纳米粒子的红外光谱。通过动态光散射(DLS)的方法测量纳米粒子的水合动力学直径分布。用透射电子显微镜(TEM)观察纳米粒子的形貌。采用振动样品磁强计(VSM)测定纳米粒子的饱和磁化强度、矫顽力和剩磁。用紫外-可见吸收光谱仪(UV)测定各样品中铁元素的含量。用小动物核磁共振成像仪扫描不同浓度的样品，根据各浓度信号强度拟合出DOTA-SPIONs-PEG-FA的弛豫率。

1.364Cu的标记反应

1.3.1 配体浓度对标记率的影响 分别取100 μL溶有1 μg、10 μg、100 μg、1 mg DOTA-SPIONs-PEG-FA的0.1 mol/L醋酸铵缓冲溶液(pH=6.5)，加入到2 mL EP管中，再加入100 μL(约52 MBq)的64CuCl2，涡旋混匀，在40 ℃下孵育45 min，然后用快速薄层层析法测定标记率。

1.3.2 温度对标记率的影响 取100 μL溶有10 μg DOTA-SPIONs-PEG-FA的0.1 mol/L醋酸铵缓冲溶液，加入到2 mL EP管中，再分别加入70 μL (约37 MBq)的64CuCl2，涡旋混匀，分别在40、60、80、100 ℃下孵育45 min，然后用快速薄层层析法测定标记率。

1.4 标记物的纯化和体外稳定性

取5 mg的DOTA-SPIONs-PEG-FA溶于500 μL醋酸铵缓冲溶液(pH=6.5)，加入到2 mL EP管中，再加入64CuCl2(约296 MBq)，涡旋混匀，在60 ℃下孵育45 min。

采用超滤浓缩离心管离心的方法进行纯化。将标记物移至超滤浓缩离心管上层，在5 000 r/min的条件下离心10 min，弃去下层液体，上层残余物分别用500 μL 10 mmol/L DTPA和1 mmol/L DTPA溶液洗涤各一次，离心，至下层滤液基本无放射性活度检出，然后收集上层残余物。

采用快速薄层层析法(instant thin layer chromatography, ITLC)测定64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA的标记率和放化纯度。取2 μL反应液点样于Whatman 1号层析纸上，用φ=10%醋酸铵/甲醇混合液(体积比为50∶50)配制的15 mmol/L EDTA溶液为展开剂展开并用放射型薄层扫描仪扫描，测定标记率或放化纯度。

非靶向标记物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH的标记和纯化方法与64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA相同。

将100 μL64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA标记物(约0.37 MBq)，加入到200 μL磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH=7.4)中，在37 ℃下温育，用快速薄层层析法测定标记物在4、12 h的放化纯度，观察标记物的体外稳定性。

1.5 荷瘤鼠体内生物分布

取18只荷KB细胞裸鼠，随机分成2组，每组9只。一组经尾静脉注射100 μL溶有64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA(约0.37 MBq)的生理盐水溶液，另一组经尾静脉注射100 μL溶有64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH(约0.37 MBq)的生理盐水溶液，并分别在给药后1、3、6 h各个时间点取3只荷瘤鼠摘眼球取血，继而断颈处死，取心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉、股骨、瘤称重，并用γ计数器测定放射性计数，经衰变校正后，计算百分注射剂量率 (%ID/g)。

1.6 荷瘤鼠的MRI和PET/CT显像

取荷KB细胞裸鼠3只，一只作为空白组；一只先经尾静脉注射50 μL FA-PEG(200 μg)进行叶酸受体阻断，30 min后再注射100 μL DOTA-SPIONs-PEG-FA(20 μg)；一只经尾静脉注射100 μL DOTA-SPIONs-PEG-FA(20 μg)。在给药后4 h进行MRI显像。

取荷KB细胞裸鼠3只，一只经尾静脉注射100 μL非叶酸受体靶向标记物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH(约18.5 MBq)；一只先经尾静脉注射50 μL FA-PEG(200 μg)进行叶酸受体阻断，30 min后再注射100 μL64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA(约18.5 MBq)；一只经尾静脉注射100 μL64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA(约18.5 MBq)。在给药后4 h进行PET/CT显像。

2 结果与讨论

2.1 纳米粒子的合成与表征

首先在N2保护和避光的条件下，将叶酸与过量的DCC和NHS反应生成叶酸的活性酯FA-NHS。然后，用一端含有羧酸基团，另一端含有氨基基团的PEG在N，N-二异丙基乙基胺存在下，与FA-NHS偶联得到FA-PEG的粗产物并进行透析纯化。FA-PEG的1H NMR谱结果如下：δ= 8.60(1H，N=CH-C，pteridine(a))；7.68，6.62(4H，—C4H4—，Ph(c,d))；4.55(2H,—CH2—(b) )；4.31(1H,CH(e))；3.31～3.50(182H,—CH2CH2O—,PEG(h，i))；2.19～2.38(6H,—CH2—(f，g，j))；2.50(DMSO)[12]。核磁共振氢谱表明，叶酸已与PEG偶联。

采取化学共沉淀法合成氧化铁纳米粒子核心。然后，使用APTES对纳米粒子表面进行修饰，利用APTES上的氨基与FA-PEG上的羧基反应，得到SPIONs-PEG-FA。最后，将DOTA中的一个羧基活化，并与纳米粒子表面剩余的氨基反应，得到标记物前体DOTA-SPIONs-PEG-FA。

图3 SPIONs(a)、SPIONs-APTES(b)、SPIONs-PEG-FA(c)、DOTA-SPIONs-PEG-FA(d)的FTIR光谱Fig.3 FTIR spectra of SPIONs(a), SPIONs-APTES(b),SPIONs-PEG-FA(c), DOTA-SPIONs-PEG-FA(d)

纳米粒子的粒径用透射电镜进行了观测。SPIONs-APTES和SPIONs-PEG-FA的TEM图示于图4。由图4可知：SPIONs-APTES为不规则颗粒，有团聚现象，粒径介于50～100 nm；与SPIONs-APTES比较，包覆PEG后的纳米粒子SPIONs-PEG-FA的分散性和均匀性较好，粒径明显增大，粒径介于100～200 nm。

纳米粒子在溶液状态中的粒径分布情况用动态光散射法进行研究。在水溶液中，SPIONs-APTES和SPIONs-PEG-FA的DLS测定结果示于图5。由图5可知，强度权重的DLS显示均为单峰，平均水合动力学粒径分别为86 nm和133 nm。其结果与TEM结果一致。

通过磁滞回线的研究可以揭示纳米材料是否具有超顺磁性。SPIONs和DOTA-SPIONs-PEG-FA的磁性测定结果示于图6。由图6可知：其磁滞回线显示，纳米粒子的磁化强度随外加磁场强度的增大而增大，当外加磁场强度增大到一定值(10 G)后，磁化强度的增加趋于平缓并逐渐达到饱和；SPIONs和DOTA-SPIONs-PEG-FA的饱和磁化强度分别为35.6 emu/g和7.9 emu/g，DOTA-SPIONs-PEG-FA的剩磁为0.2 emu/g，几乎可以忽略不计，说明其具有超顺磁性[14-15]。

图4 SPIONs-APTES(a)和SPIONs-PEG-FA(b)的TEM图Fig.4 TEM images of SPIONs-APTES(a) and SPIONs-PEG-FA(b)

图5 SPIONs-APTES(a)和SPIONs-PEG-FA(b)的水合动力学直径分布Fig.5 Hydrodynamic size distribution of SPIONs-APTES(a) and SPIONs-PEG-FA(b)

图6 SPIONs(a)和DOTA-SPIONs-PEG-FA(b)的磁滞回线Fig.6 Hysteresis loops of SPIONs(a) and DOTA-SPIONs-PEG-FA(b)

T2对比剂降低横向弛豫时间，通过减少组织信号来辨别组织正常与否。有外加磁场时，信号强度减弱，影像变黑，从而产生信号对比，可以辨别组织间的差异。DOTA-SPIONs-PEG-FA中不同铁浓度时，T2权重MR的显像结果示于图7。由图7可知，随着DOTA-SPIONs-PEG-FA中Fe浓度的增加，MRI图像的负对比效果越来越明显，信号强度逐渐减弱，影像逐渐变黑。

根据不同浓度下弛豫时间的差异拟合获得两者之间的线性关系[16]，其线性方程为y=50.404x+5.514。据此计算得到该纳米粒子的弛豫率R2=55.9 L/(mmol·s)。采用邻菲罗啉分光光度法测定样品中铁的含量[17]。每毫克样品SPIONs、SPIONs-APTES、SPIONs-PEG-FA、DOTA-SPIONs-PEG-FA中铁含量分别为667、531、151、129 μg。

图7 DOTA-SPIONs-PEG-FA中不同铁浓度时，T2权重MR的显像结果Fig.7 T2-weighted MRI scan of DOTA-SPIONs-PEG-FA at different iron concentrations

上述超顺磁性和T2对比效果研究表明，DOTA-SPIONs-PEG-FA可以作为MRI显像的组分。

2.264Cu的标记

由于64Cu的制备比较复杂，国内64Cu药物的研究很少。本研究组曾进行了64Cu标记超顺磁性氧化铁纳米粒子SPION-DOPA-DOTA/RGD的研究[18]。

2.2.1 配体质量对标记率的影响 标记反应在醋酸铵缓冲溶液(pH=6.5)、40 ℃下进行，反应时间为45 min，考察用52 MBq的64Cu标记时，不同配体(DOTA-SPIONs-PEG-FA)质量对标记率的影响，结果示于图8(a)。由图8(a)可知，随着配体质量的增加，标记率显著提升。当配体质量为1 μg时，标记率并不理想，仅为2.2%；当配体质量增加到1 mg时，标记率显著提高，达到13.2%，但标记率曲线并没有出现平缓的趋势。由此推测，造成标记率不高的原因可能是结合在纳米粒子表面的双功能螯合剂(DOTA)有限，并且结合的螯合剂还可能被PEG所覆盖，不利于与64Cu的结合。考虑到后续可能进行的小动物PET显像实验，必须控制注射液的体积不能过大，选择100 μL醋酸铵缓冲溶液溶解配体可满足体积要求。增加配体质量可以使标记率显著提高，但是考虑到配体在醋酸铵缓冲溶液中的溶解度，100 μL的醋酸铵缓冲溶液只能溶解1 mg配体。因此，选择配体质量为1 mg标记52 MBq的64Cu。

(a)——醋酸铵缓冲溶液(pH=6.5)，40 ℃，反应时间为45 min，A(64Cu)=52 MBq；(b)——A(64Cu)=37 MBq，m(配体)=10 μg，反应时间为45 min图8 配体质量(a)和反应温度(b)对标记率的影响Fig.8 Influences of ligand mass(a) and reaction temperature(b) on labeling efficiency

2.2.2 反应温度对标记率的影响 以37 MBq的64Cu标记10 μg配体，反应时间为45 min条件下，考察不同温度对标记率的影响，结果示于图8(b)。参照文献[19]进行了温度对标记率影响的研究，将初始温度设为40 ℃，标记率仅为4.5%。当温度升至60 ℃时，标记率提高到19.5%。温度在80～100 ℃，标记率增加不大。考虑到较高的温度可造成纳米粒子的团聚或表面包覆物的脱落，降低纳米粒子的稳定性。在实验中也发现，在80 ℃时，纳米粒子在水溶液中出现了沉淀现象。因此，经综合考虑，选择60 ℃为标记温度。

2.3 标记化合物的纯化

利用纳米粒子具有较大分子量的特点，采取超滤浓缩离心法纯化64Cu纳米材料的标记物。选取10 kDa的超滤浓缩离心管，经离心分离后，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在离心管的上层，而游离的64Cu随滤液到达离心管的下层。在上层残余物中加入DTPA溶液，以络合残留的游离64Cu和与纳米粒子非特异性结合的64Cu，离心分离至下层滤液中基本无放射性检出为止，收集所有滤液。上层残余物的放射性活度除以上层残余物和所有滤液的活度之和，即可得到该反应的标记率，在优化条件下，其标记率为23%。经DTPA溶液洗涤纯化后的产物用薄层层析法检测其放射性化学纯度，标记物集中在原点附近，Rf=0～0.1，而游离的64Cu(Rf=0.6～0.7)很少。这说明64Cu已成功标记到DOTA-SPIONs-PEG-FA，且放化纯大于98%。

刚开始进行标记物纯化时，按文献[20]进行超滤浓缩离心法纯化，采用生理盐水洗涤上层残余物，但实验中发现用500 μL生理盐水洗涤5次，纯化效果仍不理想，放化纯只能达到90%。后由文献[21-22]知，DTPA能与64Cu形成稳定的配合物，竞争络合与纳米材料非特异性结合的64Cu。因此，最后采用DTPA溶液进行洗涤，显著提高了分离效果。本研究中分别用10 mmol/L和1 mmol/L的DTPA溶液500 μL各洗涤1次，放化纯即可达98%。

2.4 标记化合物的体外稳定性

64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在PBS中的体外稳定性结果示于图9。由图9可知，在37 ℃下，PBS体系中放置4 h，该标记物的放化纯从初始的98%下降至93%，而一个半衰期(12 h)后，放化纯降至85%。这表明该标记物在4 h内基本稳定。

θ=37 ℃图9 64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA的体外稳定性Fig.9 In vitro stability of 64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA

2.5 荷瘤鼠体内生物分布

人口腔表皮样KB肿瘤细胞系被认为是进行叶酸靶向研究的“金标准”。由于KB细胞具有高且稳定的叶酸受体表达水平，传统上KB细胞常被用于叶酸靶向研究[23]。因此，以荷KB细胞瘤的裸鼠为对象进行了体内生物分布及MRI和PET/CT的显像研究。靶向标记物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA和非靶向标记物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH在荷KB细胞裸鼠体内的生物分布结果列于表1。由表1可知：两种标记物在肝脏中((21.04±3.39)%ID/g，(25.03±3.07)%ID/g；6 h)的放射性摄取都很大；64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在脾((15.04±2.68)%ID/g，6 h)和肺((29.83±3.92)%ID/g，6 h)中的放射性摄取也较大。64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在肝、脾和肺的高摄取主要与巨噬细胞的吞噬作用有关。体内的网状内皮系统(RES，包括肝、脾、肺和骨髓等组织)具有丰富的吞噬细胞，可将一定大小的纳米颗粒作为异物而摄取，较大的颗粒由于不能滤过毛细血管，而被截留于某些部位。

与未连接叶酸的标记物相比，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在肿瘤中的摄取明显增高。64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA和64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH在给药1 h的放射性摄取率分别为(9.76±5.27)%ID/g和(1.41±0.36)%ID/g；给药3 h的放射性摄取率分别为(8.81±8.30)%ID/g和(1.52±0.60)%ID/g；给药6 h的放射性摄取率分别为(8.90±3.31)%ID/g和(2.09±0.63)%ID/g。这表明连接叶酸后，纳米粒子对KB细胞瘤具有明显的主动靶向作用。

表1 64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA和64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH在荷KB细胞裸鼠体内的生物分布

注：n=3

在给药1、3、6 h时，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA的肿瘤和血液的放射性摄取率比(T/B)分别为6.82、6.67、6.74；而64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH的T/B分别为0.65、0.52、0.68。连有叶酸纳米粒子的T/B明显高于无叶酸连接的纳米粒子，并且在1～6 h内T/B均大于6，这表明64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在肿瘤中具有较长的滞留时间，靶与非靶组织反差明显，可在较宽的时间范围内对肿瘤进行显像。

2.6 荷瘤鼠的MRI和PET/CT显像

荷KB裸鼠给药4 h后的MRI和PET/CT图像示于图10。超顺磁性氧化铁纳米粒子在MRI成像中作为T2造影剂，通过网状内皮系统中的吞噬细胞吞噬SPIONs后使相应的区域信号减弱。由图10(a)可知，空白组中KB细胞肿瘤部位最为明亮；当对叶酸受体进行阻断后(图10(b))，图像也稍变暗，这可能是因为尽管叶酸受体已被阻断，DOTA-SPIONs-PEG-FA的主动靶向不起作用，但该纳米粒子仍可能通过实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeation and retenting, EPR)被肿瘤少量摄取[24]，因此，使得MRI信号减弱。图10(c)显示，注射DOTA-SPIONs-PEG-FA 4 h后肿瘤部位信号减弱幅度大，MRI图像变得最暗。这表明DOTA-SPIONs-PEG-FA在肿瘤部位有最大摄取，其摄取是与叶酸受体密切相关的，DOTA-SPIONs-PEG-FA可作为叶酸受体主动靶向的KB肿瘤MRI造影剂。

从PET/CT图像可知(图10(d, e))，注射了未含有叶酸的非靶向标记物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH以及先经叶酸阻断后再注射叶酸受体靶向标记物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA，药物在肿瘤部位的放射性摄取均较少，与肌肉相比没有显示出大的差异。而直接注射叶酸受体靶向标记物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA后，药物在肿瘤部位的摄取明显增高(图10(f))。这说明64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA对KB细胞肿瘤确有靶向性，这种靶向是通过与叶酸受体的作用而实现，是主动靶向。作为KB细胞肿瘤的PET/MRI双模态显像剂，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA有待于进行更深入的研究。在三种情形下，给药4 h后，药物在肝脏中的摄取都较高(图10(d,e,f))。这与纳米材料在肝中被巨噬细胞吞噬有关。

箭头所指为肿瘤部位(a)——空白对照组，(b)——叶酸阻断后再注入DOTA-SPIONs-PEG-FA，(c) ——DOTA-SPIONs-PEG-FA，(d)——64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH，(e)——叶酸阻断后再注入64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA，(f)——64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA图10 荷KB裸鼠给药4 h后的MRI (a—c)和PET/CT图像(d—f)Fig.10 MRI images(a-c) and PET/CT images(d-f) of nude mice bearing KB cells tumor after 4 h injection

3 结 论

以化学共沉淀法先合成了超顺磁氧化铁纳米核心，并用APTES、FA-PEG-COOH和DOTA对纳米粒子表面逐次进行了修饰，获得了DOTA-SPIONs-PEG-FA。接着，用正电子核素64Cu对其进行了标记并纯化，制备了可用于PET/MRI双模态分子显像的64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA探针，经过分离纯化得到了放化纯大于98%的标记物，并对其体外稳定性、在荷KB细胞裸鼠的体内生物分布及在MRI和PET/CT模式下的显像进行了研究。结果表明，与64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH相比，连接有叶酸的标记物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA对KB细胞肿瘤表现出明显的主动靶向作用，MRI和PET/CT肿瘤成像较清晰。作为KB细胞肿瘤的PET/MRI双模态显像剂，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在向临床医学转化之前还需要解决许多问题，如合成过程中更精密的控制(64Cu标记率的提高、放射性比活度和稳定性的改善)、合成中间产物更严密的分析鉴定和定量检测、体外细胞结合实验研究、代谢产物分析研究以及纳米材料的毒理学研究等。后续的工作将围绕这些问题而展开。

[1] Stewart B W, Wild C P. World cancer report 2014[R]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer, 2014.

[2] Madduri S, Galliford C V, Low P S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2015, 14(3): 203-219.

[3] Low P S, Henne W A, Doorneweerd D D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases[J]. Acc Chem Res, 2008, 41(1): 120-129.

[4] Muller C, Schibli R. Folic acid conjugates for nuclear imaging of folate receptor-positive cancer[J]. J Nucl Med, 2011, 52(1): 1-4.

[5] Spick C, Herrmann K, Czernin J.18F-FDG PET/CT and PET/MRI perform equally well in cancer: evidence from studies on more than 2,300 patients[J]. J Nucl Med, 2016, 57(3): 420-430.

[6] Rosales R T M. Potential clinical applications of bimodal PET-MRI or SPECT-MRI agent[J]. J Label Compd Radiopharm, 2014, 57(4): 298-303.

[7] 沈浪涛.放射性药物化学领域中的重要事件和前沿[J].核化学与放射化学，2015，37(5)：355-365.

[8] Joel G, Tang T, Louie A Y. Nanoparticle-based multimodal PET/MRI probes[J]. Nanomedicine, 2015, 10(8): 1343-1359.

[9] Yallapu M M, Foy S P, Jain T K, et al. PEG-functionalized magnetic nanoparticles for drug delivery and magnetic resonance imaging application[J]. Pharm Res, 2010, 27(11): 2283-2295.

[10]Harivardhan R L, Arias J L, Julien N, et al. Magnetic nanoparticles: design and characterization, toxicity and biocompatibility, pharmaceutical and biomedical applications[J]. Chem Rev, 2012, 112(11): 5818-5878.

[11]Chen T J, Cheng T H, Hung Y C, et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI[J]. J Biomed Mater Res A, 2008, 87(1): 165-175.

[12]Yoo M K, Park I K, Lim H T, et al. Folate-PEG-superparamagnetic iron oxide nanoparticles for lung cancer imaging[J]. Acta Biomaterialia, 2012, 8(8): 3005-3013.

[13]Jiang Q L, Zhang S W, Hong R Y, et al. Folic acid-conjugated Fe3O4magnetic nanoparticles for hyperthermia and MRIinvitroandinvivo[J]. Appl Surf Sci, 2014, 307(1): 224-233.

[14]王晓，崔海平，史旭东，等.SPECT/MRI双模态显像剂SPION-DMSA-99Tcm的制备及其性质研究[J].原子能科学技术，2015，49(9)：1557-1564.

[15]王晓，崔海平，史旭东，等.新型SPECT/MRI双模态显像剂SPION-DMSA-RGD-99Tcm的合成和生物学评价[J].原子能科学技术，2015，49(11)：1932-1938.

[16]Lee H Y, Li Z, Chen K, et al. PET/MRI dual-modality tumorimaging using arginine-glycine-aspartic(RGD)-conjugated radiolabeled iron oxide nanoparticles[J]. J Nucl Med, 2008, 49(8): 1371-1379.

[17]中华人民共和国机械行业标准.JB/T 6237.3-2008,第三部分：邻菲罗啉分光光度法测定铁量[M].北京：机械工业出版社,2008.

[18]史旭东，王晓，申一鸣，等.超顺磁性氧化铁纳米粒子SPION-dopa-PEG-DOTA/RGD的64Cu标记、纯化及生物学初步评价[J].核化学与放射化学，2015，37(4)：250-256.

[19]Stockhofe K, Postema J M, Schieferstein H, et al. Radiolabeling of nanoparticles and polymers for PET imaging[J]. Pharmaceuticals, 2014, 7(4): 392-418.

[20]Rosales R T M, Tavaré R, Paul R L, et al. Synthesis of64CuⅡ-bis (dithiocarbamate-bisphosphonate) and its conjugation with superparamagnetic iron oxide nanoparticles:invivoevaluation as dual-modality PET-MRI agent[J]. Angew Chem Int Ed, 2011, 50(24): 5509-5513.

[21]Fukukawa K, Rossin R, Hagooly A, et al. Synthesis and characterization of core-shell star copolymers forinvivoPET imaging applications[J]. Biomacromolecules, 2008, 9(4): 1329-1339.

[22]Pressly E D, Rossin R, Hagooly A, et al. Structural effects on the biodistribution and positron emission tomography (PET) imaging of well-defined64Cu-labeled nanoparticles comprised of amphiphilic block graft copolymers[J]. Biomacromolecules, 2007, 8(10): 3126-3134.

[23]Müller C, Schubiger P A, Schibli R.Invitroandinvivotargeting of different folate receptor-positive cancer cell lines with a novel99mTc-radiofolate tracer[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2006, 33(10): 1162-1170.

[24]Maeda H. Tumor-selective delivery of macromolecular drugs via the EPR effect: background and future prospects[J]. Bioconjugated Chemistry, 2010, 21(5): 797-802.

64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA as a Potential PET/MRI Dual-Modal Imaging Tumor Probe Used for Targeting Folate Receptor-Positive Cancer

SUN Yu-lin1,2, SHEN Yi-ming1,2, LIANG Ji-xin1, CHEN Yu-qing1,2, SHEN Lang-tao1,2,*

1.China Institute of Atomic Energy, P. O. Box 275(58), Beijing 102413, China;2.Atom-Hitech Company, Beijing 102413, China

The synthesis, preliminary biological evaluation and PET/CT and MRI imaging results of a potential PET/MRI dual-modal imaging tumor probe,64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA, used for targeting folate receptor-positive cancer, have been reported in this investigation. This probe was composed of a superparamagnetic iron oxide nanoparticles(SPIONs) coated with the biocompatible polymer poly(ethylene glycol)(PEG), folic acid, 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid(DOTA) and positron-emitter copper-64. This radioactive probe has high radiochemical purity(greater than 98%) after purification. The bio-distribution in the nude mice bearing KB cells tumor shows that64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA has a higher uptake in liver, spleen and lung, respectively, and has an obvious effect of active targeting toward the KB tumor in contrast to64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH. Under the modes of both MRI and PET/CT, the KB tumor can be observed clearly. As a PET/MRI dual-modal imaging tumor probe,64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA is worthy to be further studied to improve its labeling yield, stability, specific activity and so on.

PET/MRI dual-modal probe; superparamagnetic iron oxide nanoparticles; folic acid; DOTA;64Cu

2016-05-12；

2016-06-13

孙钰林(1982—)，男，辽宁本溪人，博士研究生，放射性同位素技术专业，E-mail: alinzaixian@163.com

*通信联系人：沈浪涛(1963—)，男，浙江永康人，研究员，博士生导师，主要从事药物化学和有机合成化学研究，E-mail: shenlt@yahoo.com

O615.4

A

0253-9950(2017)04-0298-11

10.7538/hhx.2017.39.04.0298