DNA复制的酶学机理

林 权 胡雪峰

(福建师范大学生命科学学院 福州 350108)

DNA复制分为解螺旋、合成新链、形成两个子代DNA分子三个主要步骤，每个步骤对应着更为复杂的过程，这些过程均需要酶的催化。人教版高中生物学教材必修2中简单介绍了DNA复制的过程，本文结合高中生物学教材的内容，在DNA复制流程的基础上，介绍相关酶的功能及其作用机理。

1 DNA解旋酶作用氢键解开DNA双链

DNA复制是指以亲代DNA的两条单链区域为模板合成子代DNA的过程，发生在有丝分裂间期的S期和减数第一次分裂前间期的S期。DNA分子为反向平行双螺旋结构，复制起始需在复制起始识别蛋白和DNA解旋酶共同作用下打开DNA双链片段，为后续新链的合成提供模板。

解旋酶是指利用ATP水解获得能量打开氢键解开双链DNA，并附着于DNA分子上沿一定方向移动的一类酶。复制起始识别蛋白识别复制起点，随后环状结构的解旋酶围绕在复制起点处的一条DNA链上，沿复制叉(以解开的两条DNA单链区域为模板，从一个固定的起点开始复制，形成的结构类似叉子，故称复制叉[1])前进的方向移动并断开碱基对之间的氢键，解开局部双链。紧接着，单链结合蛋白结合于DNA单链区域，阻止单链DNA重新缔合成双链。

2 DNA拓扑异构酶消除正超螺旋

DNA拓扑异构酶的主要功能是消除正超螺旋。DNA复制过程中复制叉向前移动会积累巨大的张力，致使DNA分子的双螺旋变紧，即产生正超螺旋，阻碍了DNA的解旋和复制。DNA拓扑异构酶分为DNA拓扑异构酶Ⅰ和DNA拓扑异构酶Ⅱ，DNA拓扑异构酶Ⅰ断开一条DNA链上的磷酸二酯键，而DNA拓扑异构酶Ⅱ作用于两条DNA链上的磷酸二酯键，使单链或双链DNA片段适当旋转舒展DNA链，再连接磷酸二酯键，达到释放张力的目的。因此，DNA拓扑异构酶可作为DNA解旋酶的“先导部队”，消除阻碍解旋进行的正超螺旋[2]。

3 DNA新链的合成

3.1 引发酶催化合成RNA引物 DNA聚合酶不能从头起始DNA新链的复制，只能在已有引物的3′-OH末端继续延伸。引发酶利用核糖核苷酸为底物，按照碱基互补配对原则，合成RNA引物产生3′-OH末端，为DNA聚合酶合成新链做铺垫。DNA半保留复制中，DNA的结构为反向平行，合成DNA的底物为5′-核苷三磷酸，只能5′-位的磷酸基团连接到引物的3′-OH上形成磷酸二酯键，故DNA复制的方向只能按新链5′→3′方向进行。复制时，DNA的一条新链按与复制叉移动方向一致的方向进行合成，即沿新链DNA 5′→3′方向连续合成，称为前导链；另一条链按与复制叉移动方向相反的方向，沿新链DNA 5′→3′方向合成多个小片段DNA，小片段DNA称为冈崎片段，再通过连接酶将冈崎片段连接成完整的链，称为后随链[1]。前导链连续复制，只需要一个RNA引物，而后随链的合成是不连续的，每个冈崎片段都需要一个RNA引物。

3.2 DNA聚合酶合成亲代DNA的互补链 DNA聚合酶Ⅲ是原核生物DNA复制的主要酶，具有5′→3′的聚合酶活性。DNA复制以复制叉处解开的两条DNA单链区域为模板，利用游离脱氧核苷酸的5′-核苷三磷酸与RNA引物的3′-OH发生酯化反应，形成磷酸二酯键，展开前导链和后随链的合成。真核生物中，DNA聚合酶α结合在引物-模板接头上，起始新链的合成。然而其持续性低，每次与引物-模板结合最多只能添加100个左右的脱氧核苷酸[3]。后续的DNA合成由具备高持续合成能力的DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε完成[1]。

4 形成两个新的DNA分子

前导链和冈崎片段一旦合成，其RNA引物就要被切除。原核生物中，引物切除后的空缺由DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合酶活性利用脱氧核苷酸进行补齐，最后DNA连接酶连接冈崎片段形成一条完整的后随链。新合成的两条链与其对应的模板链相互缠绕成双螺旋结构，形成两个相同的DNA分子。

4.1 RNA引物的酶切 前导链上有一个RNA引物需切除，而后随链有多个RNA引物需要切除。原核生物中切除RNA引物的酶为DNA聚合酶Ⅰ或核糖核酸酶H[4]。DNA聚合酶Ⅰ使用5′→3′外切酶活性切除5'端的引物，核糖核酸酶H是一种专门水解与DNA杂交的RNA的核酸内切酶。真核生物的DNA聚合酶无5′→3′外切酶活性，不能切除RNA引物，而是使用核糖核酸酶和翼式核酸内切酶-1(FEN-1)进行切除，FEN-1具有5′→3′外切酶活性和内切酶活性切除RNA 引物[1]。

4.2 DNA连接酶连接冈崎片段 DNA连接酶在DNA复制、修复和重组的过程中具有十分重要的作用，其所催化的连接反应需要ATP或NAD+提供能量。不管是依赖ATP还是NAD+提供能量的DNA连接酶，其反应机理是相近的。第一步：连接酶腺苷酸化，ATP或NAD+中的腺苷酰基(AMP)移动至酶活性中心的赖氨酸残基的ε-氨基上，暴露出连接酶上的DNA结合位点，形成共价复合物中间体；第二步：中间体的腺苷酰基(AMP)转移给切口处DNA的5′-P，产生焦磷酸键，活化切口处DNA的5′-P，形成DNA-AMP中间复合物；第三步：被激活的5′-P与相邻DNA的3′-OH生成磷酸二酯键，释放出AMP，两个DNA片段连接完成(图1)。

图1 DNA连接酶催化DNA片段的连接

5 小结

总之，DNA复制的过程非常复杂，需要多种酶及蛋白因子的共同协作配合。其在复制叉处进行的基本过程包括松弛超螺旋，解开DNA区域双链，合成RNA引物，延伸前导链及后随链，RNA引物切除，冈崎片段的连接。原核生物DNA复制与真核生物DNA复制不同之处主要是：①原核生物的DNA在细胞中呈裸露状态，而真核生物的DNA与组蛋白紧密结合形成核小体颗粒，核小体盘绕螺旋构成染色质。因此，真核生物DNA复制前要先解开核小体，降低了其DNA复制的速度。②真核生物有多个复制起点，只有全部染色体完成第一轮复制，各个起点才能展开第二轮的DNA复制；原核生物虽只有一个复制起点，但是第一轮DNA复制还未结束，复制起点便又开始第二轮的复制。③真核生物DNA复制涉及的酶和蛋白因子种类比原核生物多。④真核生物的冈崎片段比原核生物小。

(基金项目：福建省“大规模教育考试试题难度影响和难度预测的研究”，No.FJJKCG14-083；* 通信作者)