影响吡罗红甲基绿染液染色效果的探究实验

尚启亮 黄雅婷 龚羚云

(安徽省合肥市第一中学 230601)

“观察DNA和RNA在细胞中的分布”是高中生物学教学中一个重要的实验，人教版教材选择口腔上皮细胞为例介绍了实验的过程。同时，也给出了两幅实验结果图，分别是口腔上皮细胞染色结果图和洋葱鳞片叶内表皮细胞染色结果图。从图中可以看到细胞核区域为绿色，细胞质区域为红色。但是，在中学实验教学中，严格按照教材实验的配方和步骤操作，实验结果并不像教材呈现得那么明显。其中，细胞质较易看到红色，但细胞核区域并没有出现教材呈现的绿色，而是呈现蓝色或蓝绿色。

查阅文献发现，甲基绿和吡罗红混合染液染色的原理主要有两个方面：①染色与聚合程度有关，甲基绿与聚合程度高的DNA优先结合呈绿色，吡罗红优先与RNA结合呈红色；②甲基绿和吡罗红在水中电离后都带正电荷，但甲基绿碱性较吡罗红要强，甲基绿易与细胞核极性吸附而染色，吡罗红易与细胞质吸附结合。因此，pH过低甲基绿染色效果差；pH过高吡罗红染色效果不良[1，2]。由染色原理可知，pH对染色结果有影响，考虑到不同材料细胞内pH可能存在差别，不同的材料对染色效果可能也存在差别。在以下探究实验中，为了不改变pH，省略了盐酸水解这一步骤。

1 实验材料

1.1 试剂 取吡罗红甲基绿粉1 g，加入100 mL蒸馏水中溶解，放入棕色瓶中保存，制成A液。取11.55 mL冰醋酸稀释至1000 mL，制成0.2 mol/L的醋酸溶液；称取27.2 g三水合醋酸钠用水溶解，定容1000 mL，制成0.2 mol/L的醋酸钠溶液，并按表1将醋酸和醋酸钠混合，配置成不同pH的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，作为B液。

表1 醋酸-醋酸钠缓冲溶液(B液)的配制

1.2 材料 本实验采用洋葱鳞片叶内表皮细胞和鸭跖草(鸭跖草科，易培养，取材方便)叶下表皮细胞。

2 方法步骤

2.1 染液 使用前，将A液和B液(不同pH)按1:4的比例配制成不同pH的吡罗红甲基绿染色剂。

2.2 染色 取洋葱鳞片叶内表皮细胞、鸭跖草叶下表皮细胞在不同pH的混合染色液中分别染色5 min、10 min和15 min。

2.3 制片 将染色过的表皮细胞放在相应pH的缓冲液中漂洗，洗去浮色；在载玻片上滴1滴相应pH的缓冲溶液，制成临时装片。

2.4 观察 先在低倍镜下观察，看细胞核与细胞质的颜色，找到细胞核呈典型绿色的细胞后移到视野中央，再换成高倍镜继续观察。

3 实验结果

3.1 pH对染色效果的影响 采用洋葱鳞片叶内表皮细胞作为实验材料，染色15 min的条件下，当细胞质在pH为3.6时，红色最明显。在其他pH条件下，在低倍镜下也可明显观察到细胞质呈红色，细胞核的核仁区域也被染成红色。当细胞核在pH值为4.8和5.2时，绿色比较明显。在其他pH条件下，细胞核多为蓝色和蓝绿色。

采用鸭跖草叶下表皮细胞作为实验材料时，当pH为4.0、4.4、4.8和5.2时，细胞核均可看到明显的绿色。当pH为3.6和5.6时，细胞核染色偏蓝。

3.2 染色时间对染色效果的影响 在pH为5.2的条件下，采用洋葱鳞片叶内表皮细胞作为实验材料时，染色5 min、10 min和15 min条件下，细胞质和细胞核的核仁区域都被染成红色，区别不大。细胞核的着色情况存在区别，染色15 min绿色最为明显。当染色时间延长为90 min时，洋葱鳞片叶内表皮细胞的细胞核区域颜色会变深，呈现偏蓝和偏紫的情况，但对细胞质和核仁影响不大。

采用鸭跖草叶下表皮细胞作为实验材料时，当pH为4.0～5.2条件下，染色5 min与染色10 min、染色15 min细胞核区域均表现为明显的绿色。

4 讨论与建议

4.1 材料选择对染色效果的影响 实验表明：与洋葱鳞片叶内表皮细胞相比，采用鸭跖草叶下表皮细胞作为实验材料，细胞核区域更容易观察到典型的绿色，并对缓冲溶液的pH要求不高。另外，用不同材料进行细胞核染色结果相差较大，实验还曾选用鸭跖草科的植物饭包草、堇菜科的植物堇菜及动物材料猪肝等，发现鸭跖草科的鸭跖草和饭包草效果都较明显，而其他材料效果一般。因此，在实验前，就地多选取几种实验材料进行预实验，找出较好的实验材料进行实验，建议可优先考虑鸭跖草科的植物。

4.2 省略盐酸水解，选择适宜的pH 醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH范围有限制，若采用磷酸盐缓冲液，当pH为2.2～3.0时，细胞核区域呈现明显的蓝色。8 %的盐酸为强酸，水解后虽有漂洗，但无法将细胞内的盐酸彻底去除，这也可能是按教材步骤操作，细胞核区域呈现蓝色的原因。如果在实验操作过程中省略用8 %盐酸水解的步骤，一方面可以节约时间，另一方面也可减少对pH的影响。pH对染色效果的影响还因材料的不同而有区别，可在实验操作前，配置不同pH的缓冲液做预实验，根据染色结果，选择恰当pH的缓冲液。

4.3 合理利用染色时间 实验表明：染色15 min结果依然较明显。在实验课堂上，教师可以利用这个时间间隙对实验进行讲解和引导。