基于SOE-PCR的核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的构建及免疫效果研究

赵佳琪，王婉莹，范业宁，马春平，张东红，吕 扬，赵 臣

(吉林医药学院检验学院，吉林吉林 132013)



基于SOE-PCR的核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的构建及免疫效果研究

赵佳琪，王婉莹，范业宁，马春平，张东红，吕 扬，赵 臣△

(吉林医药学院检验学院，吉林吉林 132013)

目的 构建pIRES2-MLAA34-HSP70重组质粒，并检测其免疫效果。方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)的方法提取急性单核细胞白血病相关抗原基因MLAA-34和热休克蛋白(HSP)70基因，设计特异性重叠引物，以重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增MLAA34-HSP70融合基因，构建核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70。将核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，检测小鼠脾淋巴细胞对U937细胞的杀伤作用及小鼠脾细胞悬液中白细胞介素(IL)-2、IL-4和γ干扰素(IFN-γ)水平。结果 扩增出MLAA34-HSP70融合基因2 956 bp，成功构建了核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70，经鉴定与预期结果一致；脾淋巴细胞杀伤活性结果显示，核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70对U937细胞的杀伤效率明显高于其他实验组及对照组(P<0.01)；核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70组细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平亦明显高于其他实验组及对照组(P<0.01)。结论 成功构建了pIRES2-MLAA34-HSP70核酸疫苗，该核酸疫苗能诱发强烈的体液免疫，增强机体对肿瘤细胞的免疫应答，对MLAA34阳性细胞具有特异性杀伤作用。

疫苗，DNA；重叠延伸PCR；白血病，单核细胞，急性；MLAA-34；热休克蛋白质类70

核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答反应，以达到预防和治疗疾病的目的[1]。抗原表位基因是核酸疫苗的核心部分，以融合基因为目的基因构建核酸疫苗已是业界的共识。将相同或相似功能的基因融合，可以增强目的蛋白的免疫原性，提高核酸疫苗的免疫保护效应。重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)采用互补末端引物，使PCR产物形成重叠链，从而将来源不同的多个基因片段拼接在一起[2]。利用SOE-PCR技术不需要内切酶消化和连接酶处理即可进行有效的基因重组，因而在构建融合基因、定点突变及基因敲除等方面有着广泛的应用[3]。本研究拟采用SOE-PCR技术将急性单核细胞白血病相关抗原基因MLAA-34及热休克蛋白70(HSP70)融合为MLAA34-HSP70融合基因，进而构建核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70，免疫BALB/c小鼠并检测其脾淋巴细胞对U937细胞的杀伤效应，为核酸疫苗的抗肿瘤研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 U937细胞、pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-HSP70质粒为本课题组保存。BALB/c鼠[无特定病原体(SPF)级，雌性，6～8周龄]购自北京维通利华实验动物技术有限公司。噻唑蓝(MTT)试剂、限制性内切酶(EcoRⅠ/BamHⅠ)购自美国NEB公司，总RNA提取试剂盒、无内毒素质粒提取试剂盒、逆转录PCR(RT-PCR)试剂盒、T4 DNA连接酶、胶回收纯化和酶联免疫吸附试验(ELISA)等试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，胎牛血清、RPMI 1640(高糖)培养基购自美国Hyclone公司；无水乙醇、氯仿等常规试剂均为国产分析纯。

1.2 引物设计与合成 根据质粒pIRES2-EGFP多克隆位点情况选取EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点进行基因克隆。MLAA-34基因(GenBank：AY288977.2)扩增片段理论长度为1 014 bp，HSP70基因(GenBank：NM_005345.5)扩增片段理论长度为1 927 bp，P2和P3引物设计重叠序列GGC GGC GGC GGC GGC，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表1。

表1 引物碱基序列

1.3 细胞培养及基因提取

1.3.1 U937细胞培养 U937细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37 ℃ 5%CO2，收集U937细胞并调整细胞浓度至2×105/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔加U937细胞100 μL作为脾淋巴细胞杀伤活性实验的靶细胞。

1.3.2 MLAA-34基因提取 U937细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中， 37 ℃ 5%CO2，收集培养的U937细胞，Trizol法抽提总RNA，逆转录合成互补RNA(cRNA)，分别以P1/P2和P3/P4为引物，严格按照试剂盒说明书进行RT-PCR。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30个循环；最后72 ℃ 5 min。RT-PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。

1.4 SOE-PCR扩增MLAA34-HSP70融合基因 将回收纯化的PCR产物，MLAA-34和HSP70目的基因片段作为模板，以P1、P4为引物，采用SOE-PCR法扩增融合基因MLAA34-HSP70。SOE-PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30个循环；最后72 ℃ 5 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。

1.5 核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的构建及鉴定 提取质粒pIRES2-EGFP，与回收的MLAA34-HSP70融合基因片段分别进行EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，37 ℃ 1.5 h，酶切产物经琼脂糖电泳回收纯化，利用T4 DNA连接酶将MLAA34-HSP70融合基因亚克隆至pIRES2-EGFP质粒中，16 ℃连接过夜，构建pIRES2-MLAA34-HSP70重组质粒。将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，并在卡那霉素抗性LB培养基上涂板培养。将卡那霉素抗性LB培养基上生长的阳性转化克隆子编号，用接种环挑取克隆子(不要完全挑完)于3 mL LB液体培养基中37 ℃过夜培养，次日提取pIRES2-MLAA34-HSP70质粒并进行PCR扩增和酶切鉴定。

1.6 核酸疫苗免疫BALB/c小鼠 质粒DNA大量制备和纯化(按试剂盒说明书进行)并用生理盐水调整至1.0 g/L。BALB/c鼠40只，分为4组，每组10只。对照组(A组)、实验组(B、C、D组)分别在小鼠两侧股四头肌肌内注射空质粒pIRES2、pIRES2-MLAA34、pIRES2-HSP70和pIRES2-MLAA34-HSP70，每只100 μg。小鼠每次接种前24 h，均用0.25%布比卡因100 μL预处理。在0、2、4周进行3次同样剂量免疫。

1.7 脾淋巴细胞悬液的制备 末次免疫后第7天，处死小鼠，置70%乙醇浸泡3～5 min，无菌取脾脏，置于不含胎牛血清的RPMI 1640培养基中，剪去脂肪及筋膜组织，于200目不锈钢网筛上研碎，重悬于含5%胎牛血清的Hank′s液中，2 000 r/min离心5 min，低渗裂解红细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基清洗3次，并调整浓度为1×107/mL。

1.8 脾淋巴细胞杀伤活性的检测 取步骤1.7制备的脾淋巴细胞悬液，倍比稀释。96孔细胞培养板各反应孔中加脾淋巴细胞100 μL，使效靶比分别为50∶1、25∶1、12.5∶1和6.25∶1(各设3个复孔)，在37 ℃ 5%CO2中孵育24 h，测定每组小鼠特异性淋巴细胞杀伤活性。反应结束后，每孔加入20 μL MTT工作液，37 ℃反应4 h，弃去MTT反应液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200 μL，室温振荡10 min，酶标仪测定570 nm处吸光度值(A570)。脾淋巴细胞杀伤活性(%)=[1-(反应孔A570-效应细胞对照孔A570)/靶细胞对照孔A570]×100%。

1.9 细胞因子水平的检测 将步骤1.7制备的脾淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔100 μL(各设3个复孔)，37 ℃ 5%CO2培养72 h，以纯化的MLAA-34蛋白(20 μg/mL)刺激抗原。以刀豆蛋白A(ConA，10 μg/mL)为阳性对照，未用抗原刺激孔为阴性对照，培养48 h后收集上清液，ELISA法检测细胞因子，包括白细胞介素(IL)-2、IL-4和干扰素-γ(IFN-γ)水平(严格按照试剂盒说明书操作)。

2 结 果

2.1 SOE-PCR扩增MLAA34-HSP70融合基因结果 以MLAA-34基因和HSP70基因为模板，以P1、P4为引物，采用SOE-PCR法扩增MLAA34-HSP70融合基因，经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，见图1。

1：标记物；2：MLAA34-HSP70融合基因；3：HSP70基因；4：MLAA34基因

图1 MLAA34-HSP70融合基因扩增结果

2.2 核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的构建及鉴定 将质粒pIRES2-EGFP与MLAA34-HSP70融合基因分别进行EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，采用T4连接酶将MLAA34-HSP70融合基因与pIRES2-EGFP载体连接，构建重组质粒pIRES2-MLAA34-HSP70，挑取阳性克隆菌，扩增后提取重组质粒进行PCR及EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定，经1.0%琼脂糖电泳鉴定，见图2。

2.3 脾淋巴细胞杀伤活性的检测 将核酸疫苗分组免疫小鼠后，检测致敏脾淋巴细胞对U937细胞的杀伤效率，见表2。其中，核酸疫苗D组的杀伤效率明显高于A、B、C组，差异有统计学意义(P<0.01)；而A、B、C组杀伤效率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 细胞因子水平的检测 脾淋巴细胞悬液经纯化的MLAA-34蛋白刺激后，ELISA法检测脾细胞上清液中细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平，见表3。核酸疫苗D组的细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平明显高于A、B、C组，差异均有统计学意义(P<0.01)。B组和C组上述各细胞因子水平明显高于A组，差异均有统计学意义(P<0.01)。B组和C组间上述各细胞因子水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

1：标记物；2：pIRES2-MLAA34-HSP70重组质粒；3：双酶切鉴定结果；4：PCR鉴定结果

图2 重组质粒pIRES2-MLAA34-HSP70的鉴定

*：P<0.01，与D组比较

表3 小鼠脾淋巴悬液细胞因子水平比较

*：P<0.01，与A组比较；#：P<0.01，与D组比较

3 讨 论

核酸疫苗制作简单、应用安全，是白血病免疫治疗的策略之一。核酸疫苗导入宿主体内后可被抗原提呈细胞或机体组织细胞摄取，在细胞内表达蛋白抗原，刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫保护作用好[4]。在构建核酸疫苗时笔者使用了SOE-PCR技术，将MLAA-34基因和HSP70基因融合在一起，形成MLAA34-HSP70融合基因。MLAA-34基因与急性单核细胞白血病的发生密切相关，其表达下调能显著抑制U937细胞在体外的增殖，同时会诱发白血病细胞的凋亡，是理想的急性白血病免疫治疗的靶基因[5-7]。HSP70参与肿瘤基因调控及细胞增殖，具有抗原递呈功能，能强烈刺激免疫系统针对肿瘤抗原的免疫反应，进而诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫应答，以HSP为基础的肿瘤疫苗是目前肿瘤疫苗研究中的热点[8-9]。

SOE-PCR技术的关键主要在于引物的设计，在设计引物时，重叠序列可以是基因序列上的任意位点，不需要考虑融合位点及其附近的特殊序列。通过特定的重叠互补序列的引物作为桥梁，从而使PCR扩增产物末端形成了相同的重叠链，通过重叠链的延伸将PCR扩增片段拼接起来，从而将两个目的基因融合在一起，相比于限制性内切酶的酶切和连接酶的连接更加简便快捷[10]。因此，在融合基因、突变体分子的构建过程中，特别是在人类体细胞敲除、疫苗的研究、多克隆抗体的产生，以及在植物基因工程中具有广泛的应用[11-13]。本研究设计引物时采用柔性肽基因GGC GGC GGC GGC GGC作为重叠序列，融合蛋白MLAA-34和HSP70之间以柔性肽相连接，保证了两个蛋白融合表达且正确折叠，MLAA-34和HSP70皆能发挥其独特功能，从而保证了核酸疫苗的免疫活性。实验表明，核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70免疫BALB/c小鼠后，致敏脾淋巴细胞对U937细胞具有较强的杀伤效率，明显高于其他实验组和对照组，说明核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70能有效地刺激机体产生针对U937细胞的特异性杀伤作用；此外，致敏小鼠脾细胞培养液中细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平明显增高，说明该核酸疫苗能诱发强烈的体液免疫，增强机体对肿瘤细胞的免疫应答，具有明显的免疫保护作用。

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Study on immune effect of DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 constructed by SOE-PCR*

ZhaoJiaqi，WangWanying，FanYening，MaChunping，ZhangDonghong，LvYang，ZhaoChen△

(InspectionCollegeofJilinMedicalUniversity,Jilin,Jilin132013,China)

Objective To construct the DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70,and to detect its immune effect.Methods The acute monocytic leukemia associated antigen gene MLAA-34 and heat-shock protein (HSP)70 gene were extracted by using RT-PCR.The specific overlapping primer was designed,and the fusion gene MLAA34-HSP70 was amplified by using SOE-PCR technique.Then the DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 was constructed,and BALB/c mice were immunized with this DNA vaccine.The splenic lymphocyte killing activity was detected by using MTT,levels of IL-2,IL-4 and IFN-γ were also detected by using ELISA.Results The MLAA34-HSP70 gene (2 956 bp) and the DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 was amplified and constructed successfully.The killing efficiency of DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 in U937 cells was significantly higher than that in other experimental groups and control group (P<0.01),and levels of IL-4,IL-2 and IFN-γ in DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 group were significantly higher than those in the other experimental groups and control group (P<0.01).Conclusion The DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 is constructed successfully.It is shown that the DNA vaccine induces strong humoral immunity,which could enhance immune responses to tumor cells and specificlly kill MLAA34 positive cells.

vaccines，DNA；gene splicing by overlap extension PCR；leukemia，monocytic，acute；MLAA-34；heat-shock protein 70

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.006

吉林省科技厅自然科学基金资助项目(20160101179JC)；吉林省卫生和计划生育委员会项目(2015Z071)；吉林省教育厅“十三五”科技项目(JJKH20170416KJ)；吉林省大学生创新创业课题(2015024)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201613706019)。 作者简介：赵佳琪(1996-)，在读本科，主要从事血液系统疾病免疫治疗方面的研究。△

，E-mail：s2209503@sina.com。

R733.7

A

1671-8348(2017)19-2612-03

2016-11-18

2017-02-06)