UPLC-MS/MS法同时测定裸花紫珠干浸膏中5种有效成分的含量

2017-08-14汤兵力林艳珠冯春艳刑征宇海南省食品药品检验所海口分所海口570216

中国药房 2017年21期

郑培，汤兵力，林艳珠，冯春艳，刑征宇（海南省食品药品检验所海口分所，海口 570216）

郑培＊，汤兵力，林艳珠，冯春艳，刑征宇（海南省食品药品检验所海口分所，海口 570216）

目的：建立同时测定裸花紫珠干浸膏中5种有效成分含量的方法。方法：采用超高效液相色谱-串联质谱法。色谱条件：色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18，流动相为乙腈-水（梯度洗脱），流速为0.3 mL/min，柱温为40℃，进样量为2 μL；质谱条件：多反应监测离子扫描模式，干燥气/雾化气为氮气，干燥气温度为325℃，干燥气流量为6 L/min，雾化气压力为45 psi，鞘流气温度为350℃，鞘流气流量为12 L/min，毛细管电压为4 000 V（+）、3 500 V（-），喷嘴电压为500 V。结果：木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草素、芦丁检测质量浓度线性范围分别为0.504 8～252.4 ng/mL（r＝0.999 9）、0.712 4～356.2 ng/mL（r＝0.999 0）、0.509 4～254.7 ng/mL（r＝0.996 2）、0.303 0～151.5 ng/mL（r＝0.999 8）、0.602 2～301.1 ng/mL（r＝0.999 6）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜3.0%；定量限分别为0.42、0.87、0.33、0.12、0.76 ng/mL；加样回收率分别为97.99%～101.20%（RSD＝1.3%，n＝6）、96.50%～101.20%（RSD＝1.7%，n＝6）、94.81%～99.34%（RSD＝1.7%，n＝6）、97.54%～100.51%（RSD＝1.2%，n＝6）、93.37%～98.70%（RSD＝1.9%，n＝6）。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于裸花紫珠干浸膏中5种有效成分含量的同时测定。

超高效液相色谱-串联质谱法；裸花紫珠干浸膏；木犀草苷；毛蕊花糖苷；槲皮素；木犀草素；芦丁

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of 5 effective components in Luohua zizhu dry extract.METHODS：UPLC-MS/MS was conducted.The separation was performed on an Zorbax Eclipse Plus C18column with mobile phase of acetonitrile-water（gradient elution）at the flow rate of 0.3 mL/min.The column temperature was set at 40℃and sample size was 2 μL.The analytes were detected in the multiple reaction monitoring（MRM）mode.Nitrogen was used as drying gas and atomized gas.The temperature and flow rate of drying gas were 325℃and 6 L/min.The pressure of atomized gas was 45 psi. The temperature and flow rate of sheath gas were 350℃and 12 L/min.The voltage of capillary were 4 000 V（+）and 3 500 V（-）. The voltage of nozzle was 500 V.RESULTS：The linear ranges of luteoloside，acteoside，quercetin，luteolin and rutin were 0.504 8-252.4 ng/mL（r＝0.999 9），0.712 4-356.2 ng/mL（r＝0.999 0），0.509 4-254.7 ng/mL（r＝0.996 2），0.303 0-151.5 ng/mL（r＝0.999 8）and 0.602 2-301.1 ng/mL（r＝0.999 6），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all less than 3.0%. The limit of quantitation were 0.42，0.87，0.33，0.12，0.76 ng/mL.The recoveries were 97.99%-101.20%（RSD＝1.3%，n＝6），96.50%-101.20%（RSD＝1.7%，n＝6），94.81%-99.34%（RSD＝1.7%，n＝6），97.54%-100.51%（RSD＝1.2%，n＝6），93.37%-98.70%（RSD＝1.9%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 5 effective components in Luohua zizhu dry extract.

KEYWORDSUPLC-MS/MS；Luohua zizhu dry extract；Luteoloside；Acteoside；Quercetin；Luteolin；Rutin

裸花紫珠干浸膏是由单味裸花紫珠制成浸膏的中成药；裸花紫珠具有清热解毒、收敛止血、散瘀消肿的功效，在临床上主要用于治疗术后、外伤后、药物流产后、呼吸道和消化道出血后止血，对化脓性炎症、烧伤或烫伤的治疗效果尤其显著[1-3]。裸花紫珠主要活性成分为黄酮类，包括木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草苷、芦丁等[4-5]。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）建立了快速测定裸花紫珠干浸膏中5种活性成分含量的方法，以期为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1290-6460型UPLC-MS/MS仪（美国Agilent公司）；PL-1001L型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；3-18K型高速离心机（德国Sigma公司）；KQ-600TDE型超声波清洗机（东莞市科桥超声波设备有限公司，频率：80 kHz，功率：700 W）。

1.2 试剂

裸花紫珠干浸膏（海南九芝堂药业有限公司，批号：20160101、20160201、20160301，规格：每1 g干浸膏相当于原药材5 g）；木犀草苷对照品（批号：111720-201408）、毛蕊花糖苷对照品（批号：111530-201411）、槲皮素对照品（批号：100081-201509）木犀草素对照品（批号：111520-200504）、芦丁对照品（批号：100080-201409）均购自中国食品药品检定研究院，纯度均＞98%；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1 色谱条件色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～9.5 min，20%A；9.5～10.0 min，20%→80%A；10～14 min，80%A；14～15 min，80%→20%A；15～27 min，20%A）；流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；进样量：2 μL。

2.1.2 质谱条件扫描模式：多反应监测离子扫描模式；干燥气/雾化气：氮气；干燥气温度：325℃；干燥气流量：6 L/min；雾化气压力：45 psi；鞘流气温度：350℃；鞘流气流量：12 L/min；毛细管电压：4 000 V（+）、3 500 V（-）；喷嘴电压：500 V。标准谱库信息见表1；总离子流（TIC）、提取离子流（EIC）色谱见图1。

表1 标准谱库信息Tab 1 Standard library information

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液取待测成分对照品适量，精密称定，分别置于50 mL量瓶中，加70%甲醇溶液定容，制成木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草素、芦丁质量浓度分别2.524、3.562、2.547、1.515、3.011 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液取样品适量，研细，取约1.0 g，精密称定，置于100 mL量瓶中，加70%甲醇溶液适量，超声处理20 min，放冷，加70%甲醇溶液定容，摇匀；以离心半径为8.5 cm、10 000 r/min离心20 min，滤过，精密量取续滤液5 mL，置于50 mL量瓶中，加70%甲醇溶液定容，摇匀；精密量取2 mL，置于200 mL量瓶中，加70%甲醇溶液定容，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。

2.3 线性关系考察

图1 TIC和EIC色谱图Fig 1 TIC and EIC chromatograms

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，制成木犀草苷质量浓度分别为252.400 0、25.240 0、10.096 0、5.048 0、1.009 6、0.504 8 ng/mL，毛蕊花糖苷质量浓度分别为356.200 0、35.620 0、14.248 0、7.124 0、1.424 8、0.712 4 ng/mL，槲皮素质量浓度分别为254.700 0、25.470 0、10.188 0、5.094 0、1.018 8、0.509 4 ng/mL，木犀草素的质量浓度分别为151.500 0、15.150 0、6.060 0、3.030 0、0.606 0、0.303 0 ng/mL，芦丁的质量浓度分别为301.100 0、30.110 0、12.044 0、6.022 0、1.204 4、0.602 2 ng/mL的系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，ng/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表2。

表2 回归方程、线性范围与定量限Tab 2 Regression equations，linear ranges and LOQs

2.4 定量限考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按“2.1”项下试验条件进样测定，当信噪比为10∶1时，得定量限，详见表2。

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下试验条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草素、芦丁峰面积的RSD为0.8%、1.9%、0.7%、0.6%、1.1%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20160101）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h时按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积。结果，木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草素、芦丁峰面积的RSD分别为1.6%、2.1%、1.4%、1.2%、1.5%（n＝8），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一批样品（批号：20160101）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草素、芦丁含量的平均值分别为2.41、21.37、1.41、1.95、1.64 mg/g，RSD分别为0.9%、2.2%、1.1%、1.4%、1.2%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量样品（批号：20160101）适量，共6份，分别加入一定质量的待测成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。