苯酚-硫酸法结合校正因子法测定含半乳糖醛酸的多糖中的糖含量Δ

白瑞斌，马玉玲，张 培，王燕萍，李应东，胡芳弟#（.兰州大学药学院，兰州 730000；.甘肃中医学院附属医院，兰州 730000）

苯酚-硫酸法结合校正因子法测定含半乳糖醛酸的多糖中的糖含量Δ

白瑞斌1＊，马玉玲1，张 培1，王燕萍1，李应东2，胡芳弟1#（1.兰州大学药学院，兰州 730000；2.甘肃中医学院附属医院，兰州 730000）

目的：建立一种基于苯酚-硫酸法结合校正因子法测定含半乳糖醛酸（GalA）的多糖中糖含量的方法。方法：优化苯酚-硫酸法的测定条件，以不同质量比的GalA-葡萄糖（Glc）混合对照品溶液绘制系列标准曲线并测定含GalA的党参多糖CPP1b样品中的糖含量，在此基础上，根据GalA-Glc质量比为0-100%时的回归方程，以党参多糖CPP1b为参照多糖计算校正因子，对样品中的糖含量测定结果进行校正，并以与党参多糖CPP1b组成相同的混合单糖对照品对此方法合理性进行验证。结果：经计算，党参多糖CPP1b对Glc的校正因子为3.33，验证试验中与党参多糖CPP1b组成相同的混合单糖对照品的糖含量测定结果为103.47%。精密度、稳定性试验的RSD＜1%；加样回收率为93.52%～107.35%（RSD＝5.09%，n＝6）。结论：该研究建立的方法可准确测定类似于党参多糖CPP1b的含GalA的多糖中的糖含量。

多糖；半乳糖醛酸；党参多糖CPP1b；苯酚-硫酸法；校正因子法；糖含量；测定

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for the content determination of saccharide in polysaccharides containing galacturonic acid based on phenol-sulfuric acid method combined with correction factor method.METHODS：The determination condition of phenol-sulfuric acid was optimized.A series of standard curves were drawn with glacturonic aid-glucose mixed control with different mass ratio.The content of saccharide in Codonopsis pilosula polysaccharides CPP1b samples containing galacturonic acid was determined.According to regression equation of galacturonic acid-glucose ratio of 0-100%，the correction factor was calculated by using C.pilosula polysaccharides CPP1b as the reference polysaccharide，and the results of content determination of saccharide were corrected.The rationality of this method was verified by using mixed monosaccharide control with same composition as C.pilosula polysaccharides CPP1b.RESULTS：The correction factor of C.pilosula polysaccharide CPP1b to glucose was 3.33；in validation test，the content of saccharide in mixed monosaccharide control with same composition as C.pilosula polysaccharides CPP1b was 103.47%.RSDs of precision and stability tests was＜1%.The recoveries ranged 93.52%-107.35%（RSD＝5.09%，n＝6）.CONCLUSIONS：The established method can accurately determine the content of saccharide in C.pilosula polysaccharides CPP1b containing galacturonic acid.

KEYWORDSPolysaccharides；Galacturonic acid；Codonopsis pilosula polysaccharides CPP1b；Phenol-sulfuric acid method；Correction factor method；Saccharide content；Determination

现代药理学研究证实，党参具有抗肿瘤[1]、增强机体免疫力[2]等作用，而党参多糖为其主要活性成分之一[3]。CPP1b是本课题组从党参中分离的一种酸性果胶多糖[4]，是由鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）和半乳糖醛酸（GalA）组成的杂多糖，其中含有大量的GalA。本课题组发现，对于党参多糖CPP1b这样一个高纯度多糖，采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖（Glc）对照品溶液制备标准曲线，所测得的糖含量仅为30.96%。该测定结果与高效凝胶色谱法测定结果相差甚远，其中的原因值得深入探讨。杨鸿玲等[5]认为，以某一种中性单糖为对照品测定酸性杂多糖中的总糖含量时，由于糖醛酸与中性糖的吸光系数不同，且二者形成糠醛衍生物的难易程度不同[6]，使得测定结果往往不能真实反映样品中的总糖含量。Bornik MA等[7]认为，GalA不能完全转化为糠醛衍生物，从而使得酸性多糖中糖含量的测定值低于其实际值。因此，本课题组拟建立一种能准确测定类似于党参多糖CPP1b的含GalA的多糖中糖含量的方法。

1 材料

1.1 仪器

UV-1700型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；CPA225D型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2 药品与试剂

Glc对照品（批号：110833-201205）、GalA对照品（批号：111646-200301）、Rha对照品（批号：111683-200401）、Ara对照品（批号：111506-200001）、Gal对照品（批号：100226-201105）均购自中国食品药品检定研究院（纯度均＞98%）；党参多糖CPP1b（我校实验室自制，批号：20150403，纯度：98.67%，GalA含量：83.39%）；苯酚（分析纯，上海沪宇生物科技有限公司）；硫酸（分析纯，白银良友化学试剂有限公司）；试验用水为自制蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

Glc对照品溶液：精密称取2.55 mg经105℃干燥的Glc对照品，用水定容于25 mL量瓶中，得质量浓度为0.102 mg/mL的Glc对照品溶液，4℃保存备用。

GalA对照品溶液：精密称取2.52 mg的GalA对照品，用水定容于25 mL量瓶中，得质量浓度为0.101 mg/mL的GalA对照品溶液，4℃保存备用。

党参多糖CPP1b供试品溶液：精密称取1.00 mg党参多糖CPP1b样品，用水定容于10 mL量瓶中，得质量浓度为0.100 mg/mL的党参多糖CPP1b供试品溶液，4℃保存备用。

2.2 苯酚-硫酸法测定条件的优化

2.2.1 标准曲线的绘制 分别精密量取“2.1”项下Glc对照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，加水补至2.0 mL，加入5%苯酚溶液（取5.07 g重蒸苯酚，用水定容于100 mL量瓶中）1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀后于100℃反应30 min，取出，冷却至室温，于490 nm波长处测定吸光度。以糠醛衍生物吸光度（y）为纵坐标、Glc质量浓度（x，mg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程y＝27.24x+0.009 8（r＝0.997 4）。结果表明，Glc检测质量浓度线性范围为0～0.136 mg/mL。

2.2.2 反应温度的优化 分别精密量取“2.1”项下党参多糖CPP1b供试品溶液、Glc对照品溶液、GalA对照品溶液各0.5 mL于试管中，加水补至2.0 mL，按“2.2.1”项下苯酚-硫酸法操作，于反应时间（15 min）不变的条件下，测定3种物质在不同反应温度（25、40、60、80、100℃）条件下的糖含量，由此考察反应温度对试验结果的影响（详见表1）。由表1可知，在相同反应时间条件下，随着反应温度的升高，所测得的Glc对照品的糖含量基本不变，而所测得的GalA对照品及党参多糖CPP1b的糖含量均有一定程度提高，于100℃条件下达到最大值。因此，选择100℃作为本试验的反应温度。

表1 不同反应温度对试验结果的影响（n＝3）Tab 1 Effects of different reaction temperatures on the results of the test（n＝3）

2.2.3 反应时间的优化 分别精密量取“2.1”项下党参多糖CPP1b供试品溶液、Glc对照品溶液、GalA对照品溶液各0.5 mL于试管中，加水补至2.0 mL，按“2.2.1”项下苯酚-硫酸法操作，于最佳反应温度（100℃）条件下，测定3种物质在不同反应时间（15、20、30 min）条件下的糖含量，由此考察反应时间对试验结果的影响（详见表2）。由表2可知，在最佳反应温度条件下，随着反应时间的延长，所测得的Glc对照品的糖含量先升高后下降，而所测得的GalA对照品及党参多糖CPP1b的糖含量均有一定程度提高，于30 min条件下达到最大值。因此，选择30 min作为本试验的反应时间。

表2 不同反应时间对试验结果的影响（n＝3）Tab 2 Effects of different reaction times on the results of the test（n＝3）

2.3 以不同质量比的GalA-Glc混合对照品溶液绘制系列标准曲线并测定样品中的糖含量

根据党参多糖CPP1b单糖组成及比例分析可知，其中GalA含量最高，为83.39%，因此本试验尝试以不同质量比的GalA-Glc混合对照品溶液绘制系列标准曲线，在经优化的苯酚-硫酸法测定条件下，测定党参多糖CPP1b样品中的糖含量。

2.3.1 不同质量比的GalA-Glc混合对照品溶液的制备 分别精密量取“2.1”项下GalA对照品溶液和Glc对照品溶液各适量，将二者按不同质量比混合，分别配制成GalA-Glc质量比为100%-0、90%-10%、80%-20%、70%-30%、60%-40%、50%-50%、40%-60%、30%-70%、20%-80%、0-100%的系列溶液，4℃保存备用。

2.3.2 系列标准曲线的绘制及样品中糖含量的测定 在经优化的苯酚-硫酸法测定条件下（反应温度为100℃，反应时间为30 min），以“2.3.1”项下不同质量比的GalAGlc系列混合对照品溶液，按“2.2.1”项下苯酚-硫酸法操作，分别绘制标准曲线（详见表3），并在相同试验条件下，分别于490 nm波长处对党参多糖CPP1b样品中的糖含量进行测定（详见表4）。

表3 不同质量比的GalA-Glc混合对照品溶液的回归方程和线性范围Tab 3 Regression equations and linear ranges of GalA-Glc mixed control with different mass ratios

表4 根据不同质量比的GalA-Glc混合对照品溶液的回归方程测得的样品中的糖含量（n＝3，%）Tab 4 Results of content determination of saccharide in samples according to regression equation of GalA-Glc mixed control with different mass ratios（n＝3，%）

由表3及表4可知，GalA-Glc混合对照品溶液的质量比不同时，所得回归方程的斜率有所不同，党参多糖CPP1b样品中糖含量的测定结果也不同。随着GalAGlc混合对照品溶液中GalA质量的增加，回归方程的斜率减小，所测党参多糖CPP1b样品中的糖含量呈增加趋势。其中，当以质量比为0-100%的GalA-Glc混合对照品溶液绘制标准曲线时，所测党参多糖CPP1b样品中的糖含量最低，为30.24%；当以质量比为100%-0的GalAGlc混合对照品溶液绘制标准曲线时，所测党参多糖CPP1b样品中的糖含量最高，为87.85%。由此可以推断，以GalA-Glc混合对照品溶液绘制标准曲线并测定党参多糖CPP1b样品中的糖含量，其结果与实际值存在一定的偏差。

2.4 校正因子计算及样品中糖含量测定结果的校正

由表4可知，以不同质量比的GlaA-Glc混合对照品制备系列标准曲线，其测定值与实际值均存在一定的误差，无法准确计算党参多糖CPP1b样品中的糖含量，因此本试验引入校正因子计算样品的糖含量。以中性单糖（本试验为Glc）为对照品绘制标准曲线，以党参多糖CPP1b为参照多糖计算校正因子，对样品中的糖含量测定结果进行校正。

精密量取“2.1”项下党参多糖CPP1b供试品溶液（质量浓度0.100 mg/mL）0.5 mL于试管中，加水至2.0 mL，平行制备3份，在经优化的苯酚-硫酸法测定条件下，按“2.2.1”项下方法，自“加入5%苯酚溶液”起进行余下操作，测定吸光度，根据表3中GalA-Glc质量比为0-100%时的回归方程计算党参多糖CPP1b的质量浓度（c），并按下式计算校正因子（f）：

f＝W/c·D………………………………………（1）

其中，W为称取的党参多糖CPP1b质量（mg）；c为测得的党参多糖CPP1b的质量浓度（mg/mL）；D为党参多糖CPP1b的稀释倍数。经计算，党参多糖CPP1b对Glc的校正因子为3.33（n＝3）。进而按下式校正和计算样品中的糖含量：

糖含量（%）＝（c·D·f）/W×100%……………（2）

经校正和计算，党参多糖CPP1b样品中的糖含量为99.31%（RSD＝0.55%，n＝3）。

2.5 对苯酚-硫酸法结合校正因子法合理性的验证

本试验以与党参多糖CPP1b组成相同的混合单糖对照品对苯酚-硫酸法结合校正因子法的合理性进行验证。

与党参多糖CPP1b组成相同的混合单糖对照品的制备：根据党参多糖CPP1b的单糖组成及比例，分别精密称取Rha、Ara、Gal、GalA 0.83、0.40、0.43、8.34 mg，用水定容于同一100 mL量瓶中，即得总质量浓度为0.1 mg/mL的混合单糖对照品溶液。

精密量取上述混合单糖对照品溶液0.5 mL于试管中，加水补至2.0 mL，平行制备3份，在经优化的苯酚-硫酸法测定条件下，按“2.2.1”项下方法，自“加入5%苯酚溶液”起进行余下操作，测定吸光度，根据表3中GalAGlc质量比为0-100%时的回归方程计算党参多糖CPP1b的质量浓度（c），并按“2.4”项下公式（2）计算其糖含量，结果为103.47%（RSD＝0.50%，n＝3）。表明上述苯酚-硫酸法结合校正因子法具有合理性。

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度试验 精密量取“2.1”项下党参多糖CPP1b供试品溶液（质量浓度0.100 mg/mL）0.5 mL于试管中，加水补至2.0 mL，平行制备6份，在经优化的苯酚-硫酸法测定条件下，按“2.2.1”项下方法，自“加入5%苯酚溶液”起进行余下操作，测定吸光度。结果，其吸光度的RSD＝0.21%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.6.2 稳定性试验 精密量取党参多糖CPP1b供试品溶液（0.100 mg/mL）0.5 mL于试管中，加水补至2.0 mL，在经优化的苯酚-硫酸法测定条件下，按“2.2.1”项下方法，自“加入5%苯酚溶液”起进行余下操作，分别于室温放置0、0.5、1、2、3、4 h时测定吸光度。结果，其吸光度的RSD＝0.52%（n＝6），表明供试品溶液在室温放置4 h内稳定性良好。

2.6.3 加样回收率试验 精密量取党参多糖CPP1b供试品溶液（0.100 mg/mL）0.5 mL于试管中，加入“2.1”项下GalA对照品溶液（0.101 mg/mL）0.5 mL，加水补至2.0 mL，在经优化的苯酚-硫酸法测定条件下，按“2.2.1”项下方法，自“加入5%苯酚溶液”起进行余下操作，测定吸光度，根据表3中GalA-Glc质量比为0-100%时的回归方程，按照公式（2）加校正因子计算糖含量，并计算加样回收率，结果见表5。

表5 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 5 Results of recovery tests（n＝6）

3 讨论

苯酚-硫酸法测定糖含量的原理是：多糖或寡糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解，产生单糖并迅速脱水形成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，且该衍生物在490 nm波长处的吸光度值与其质量浓度在一定范围内呈线性关系，从而可用光电比色法测定其含量[8]。其中，在形成糠醛衍生物的反应中，五碳糖和甲基五碳糖较六碳糖容易发生反应；而糖醛酸则需先脱羧，再形成糠醛衍生物[7]，且糖醛酸不能完全转化成糠醛衍生物[8]。其原理如图1所示。

图1 苯酚-硫酸法测定糖含量的原理Fig 1 Principle of phenol-sulfuric acid method

党参多糖CPP1b纯度为98.67%，糖含量为30.96%，分子量为1.45×105Da，单糖组成及质量比为：Rha∶Ara∶ Gal∶GalA＝0.25∶0.12∶0.13∶2.51，其基本的糖链接单元如图2所示。

图2 党参多糖CPP1b基本的糖链接单元Fig 2 Sugar link unit of C.pilosula polysaccharides CPP1b

而采用苯酚-硫酸法，单纯以某一种中性单糖（Glc）为对照品测定类似于党参多糖CPP1b的含GalA的酸性杂多糖中的总糖含量时，因GalA与中性单糖在测定过程中的吸光系数不同，其测定值与实际值必然会存在一定的偏差。考虑到GalA在形成糠醛衍生物前需要先脱羧且不能完全转化成糠醛衍生物，故采用苯酚-硫酸法以Glc为对照品测定党参多糖CPP1b中的糖含量时测定值会较实际值偏低。基于此，本试验结合采用了校正因子法[9-11]，通过计算党参多糖CPP1b对Glc的校正因子，对样品中的糖含量测定结果进行校正，避免了以Glc作为对照品所引起的系统误差，且绘制标准曲线简便，结果较准确、可靠。

综上所述，本试验建立了一种基于苯酚-硫酸法结合校正因子法的可快速、准确测定含GalA的多糖中糖含量的方法。验证试验结果表明方法合理，糖含量测定值与实际值很接近；方法学考察结果表明本方法精密度、准确度和稳定性均较好。这种求算校正因子的思路适用于大多数含不同比例糖醛酸的样品，但不同的样品校正因子需要视具体情况进行调整。

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Content Determination of Saccharide in Polysaccharides Containing Galacturonic Acid by Phenol-sulfuric Acid Method Combined with Calibration Factor Method

BAI Ruibin1，MA Yuling1，ZHANG Pei1，WANG Yanping1，LI Yingdong2，HU Fangdi1（1.School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；2.The Affiliated Hospital of Gansu University of TCM，Lanzhou 730000，China）

R927.2

A

1001-0408（2017）21-2974-05

2016-07-31

2017-06-15）

（编辑：周 箐）

甘肃中医药管理局科研项目（No.GZK-2014-13、GZK-2015-19）；甘肃省科技支撑计划项目（No.1504KFCA010）；兰州市科技计划项目（No.2014-2-30）

＊硕士研究生。研究方向：多糖结构分析及活性研究。E-mail：bairb12@lzu.edu.cn

#通信作者：教授，博士生导师。研究方向：中药成分分离分析及中药新药研究。E-mail：hufd@lzu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.26