RP-HPLC法同时测定热感赛比斯坦颗粒中4种成分的含量Δ

翟 欣，庞克坚，唐 辉，刘新豫，孙小雅，王亚乔（.石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆石河子 8300；.和田维吾尔药业有限责任公司，新疆和田 84800）

RP-HPLC法同时测定热感赛比斯坦颗粒中4种成分的含量Δ

翟 欣1＊，庞克坚2，唐 辉1#，刘新豫1，孙小雅1，王亚乔1（1.石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆石河子 832002；2.和田维吾尔药业有限责任公司，新疆和田 848200）

目的：建立同时测定热感赛比斯坦颗粒中没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱为Waters RP-C18，流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm（没食子酸、迷迭香酸和甘草苷）、230 nm（甘草酸铵），柱温为28℃，进样量为20 μL。结果：没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵检测进样量线性范围分别为0.274 4～7.546 μg（r＝0.999 8）、0.187 0～5.143 μg（r＝0.999 6）、0.130 0～3.575 μg（r＝0.999 9）、0.254 0～6.985 μg（r＝0.999 8）；定量限分别为2.67、1.36、1.09、2.11 ng，检测限分别为1.03、0.62、0.87、0.91 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率分别为97.26%～101.00%（RSD＝1.1%，n＝9）、97.66%～101.80%（RSD＝1.3%，n＝9）、97.45%～101.70%（RSD＝1.4%，n＝9）、97.74%～101.70%（RSD＝1.4%，n＝9）。结论：该方法简便、准确，重复性好，可用于热感赛比斯坦颗粒中没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵含量的同时测定。

热感赛比斯坦颗粒；反相高效液相色谱法；没食子酸；迷迭香酸；甘草苷；甘草酸铵

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of gallic acid，rosmarinic acid，liquiritin and ammonium glycyrrhetate in Regan saibisitan granules.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Waters RP-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were 210 nm（gallic acid，rosmarinic acid and liquiritin），230 nm（ammonium glycyrrhetate）.The column temperature was 28℃，and sample size was 20 μL.RESULTS：The linear ranges were 0.274 4-7.546 μg for gallic acid（r＝0.999 8），0.187 0-5.143 μg for rosmarinic acid（r＝0.999 6），0.130 0-3.575 μg for liquiritin（r＝0.999 9）and 0.254 0-6.985 μg for ammonium glycyrrhetate（r＝0.999 8），respectively.The LOQ were 2.67，1.36，1.09 and 2.11 ng，respectively.The LOD were 1.03，0.62，0.87 and 0.91 ng，respectively.RSDs of precision，stability and repeatability tests were all less than 2.0%.The average recoveries were 97.26%-101.00%（RSD＝1.1%，n＝9），97.66%-101.80%（RSD＝1.3%，n＝9），97.45%-101.70%（RSD＝1.4%，n＝9），97.74%-101.70%（RSD＝1.4%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be applied for simultaneous determination of gallic acid，rosmarinic acid，liquiritin and ammonium glycyrrhetate in Regan saibisitan granules.

KEYWORDSRegan saibisitan granules；RP-HPLC；Gallic acid；Rosmarinic acid；Liquiritin；Ammonium glycyrrhetate

热感赛比斯坦颗粒（国药准字：Z65020143）是维吾尔民族治疗感冒的常用药，处方由破布木果、甘草、罂粟壳等中药组成，具有清除异常胆液质、止咳、化痰的功效，可用于治疗热性感冒咳嗽、呼吸道感染[1]。本制剂收载于1998年版《中华人民共和国卫生部药品标准（维吾尔药分册）》[2]中，该标准仅采用薄层色谱法对罂粟壳和罂粟子进行定性鉴别；也有文献对热感赛比斯坦颗粒中的吗啡、甘草苷和甘草酸铵分别进行含量测定的报道[3]，但目前还未见对处方中君药破布木果进行含量测定的报道。维吾尔医认为，破布木果具有生湿生热、润肺润喉、止咳化痰、清音止渴、通便利尿的功效，主治干寒性或黑胆质性疾病[4-7]。鉴于此，本课题组采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）建立了测定热感赛比斯坦颗粒中破布木果和甘草的主要成分（没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵）含量的方法，以期为该制剂的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

e2695型HPLC仪，包括2998二级管阵列检测器、717自动进样器、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；KH-300DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率：250 W，频率：40 kHz）；BT125D型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 药品与试剂

热感赛比斯坦颗粒（新疆和田维吾尔药业有限责任公司，批号：20150602、20150711、20150910，规格：12 g/袋）；没食子酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：CAS#149-91-7，纯度：≥98%）；迷迭香酸对照品（中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-12020702，纯度：≥98%）；甘草苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：11610-201106，纯度：≥98%）；甘草酸铵对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110731-201418，纯度：≥98%）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters RP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～7 min，6%A；7～11 min，6%→45%A；11～25 min，45%→80% A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm（没食子酸、迷迭香酸、甘草苷）、230 nm（甘草酸铵）；柱温：28℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取没食子酸、迷迭香酸、甘草苷、甘草酸铵对照品各适量，分别加乙腈溶解，制成质量浓度分别为0.823 0、0.501 0、0.390 0、 0.254 0 mg/mL的单一对照品溶液；取上述单一对照品溶液各适量，置于同一10 mL量瓶中，加乙腈定容，摇匀，制成没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵质量浓度分别为137.2、93.5、65.0、127.0 μg/mL的混合对照品溶液。于4℃下避光保存备用。

2.2.2 供试品溶液 精密称取样品0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加75%甲醇溶液20 mL，称定质量，超声处理40 min，放至室温，再次称定质量，加75%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按样品的制备工艺和处方比例，取不含破布木果和甘草的其余药材制备阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以没食子酸峰计≥5 000，没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵保留时间分别为6.932、17.160、18.810、22.320 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液2、10、20、30、40、55 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

表1 回归方程与线性范围Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）与检测限（LOD）考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得LOQ；当信噪比为3∶1时，得LOD，结果见表2。

表2 LOQ与LOD测定结果（ng）Tab 2 Determination results of LOQ and LOD（ng）

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.48%、0.49%、0.35%、0.39%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20150602）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.51%、0.95%、0.77%和0.62%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置12 h内稳定性较好。

2.8 重复性试验

取样品（批号：20150602）适量，共6份，每份5.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.81%、1.90%、0.98%和0.52%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取样品（批号：20150602）适量，共9份，每份约0.5 g，精密称定，各置于10 mL量瓶中，分别加入低、中、高质量的没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

2.10 样品含量测定

取3批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

表4 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of contents determination of 3 batches of samples（n＝3，mg/g）

相关文献报道，没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵最大吸收波长分别为208、220、230、237 nm[8-10]。本试验采用紫外检测器在190～600 nm波长范围内进行全波长扫描，发现没食子酸在210、215、247 nm波长处有最大吸收，迷迭香酸在210、329 nm波长处有最大吸收，甘草苷在210、230、275 nm波长处有最大吸收，甘草酸铵在230、237 nm波长处有最大吸收；为了测定结果的准确性，本试验选择210 nm（没食子酸、迷迭香酸、甘草苷）、230 nm（甘草酸铵）为检测波长。

3.2 提取溶剂、提取方法和超声时间的考察

在预试验时，本课题组参考相关文献选择20%甲醇溶液、75%甲醇溶液、80%甲醇溶液为提取溶剂[11-13]，结果75%甲醇溶液的提取率最高，因此选择75%甲醇溶液为本试验的提取溶剂。本课题组还考察了提取方法（超声法和加热回流法），结果超声法与加热回流法的提取量相当，综合考虑超声法简便、快速易行，因此选择超声法为本试验的提取方法。此外，本课题组对超声时间也进行了考察（15、40、60 min），结果超声处理40 min和60 min时的提取量相当且均大于超声处理15 min时的提取量。为节约试验时间，最终确定本试验的超声处理时间为40 min。

3.3 流动相的选择

在预试验中本课题组还考察了不同的流动相系统（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.2%磷酸溶液），结果发现，在流动相中加入磷酸溶液时，保留时间更稳定，分离效果较好，并且乙腈-0.2%磷酸溶液比乙腈-0.1%磷酸溶液的峰形好，故选用乙腈-0.2%磷酸溶液作为本试验的流动相[14-15]。

3.4 柱温的选择

色谱柱的温度对被分离物质有较大影响，本试验考察了不同温度（25、28、30℃）对没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵色谱分离的影响。结果，柱温为25℃时，色谱峰有拖尾现象，分离度不佳；柱温为30℃时，色谱峰有上漂现象；柱温为28℃时，各待测成分的分离均较好。因此，最终确定本试验的柱温为28℃。

综上所述，本方法简便、准确、重复性好，可用于热感赛比斯坦颗粒中没食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸铵含量的同时测定。

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Simultaneous Determination of 4 Components in Regan Saibisitan Granules by RP-HPLC

ZHAI Xin1，PANG Kejian2，TANG Hui1，LIU Xinyu1，SUN Xiaoya1，WANG Yaqiao1（1.School of Pharmacy，Shihezi Univercity/Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Recourses Utilization，Ministry of Education，Xinjiang Shihezi 832002，China；2.Hotan Uygur Pharmaceuticals Co.，Ltd.，Xinjiang Hotan 848200，China）

R917

A

1001-0408（2017）21-2963-04

2016-10-02

2017-03-10）

（编辑：刘 柳）

国家自然科学基金资助项目（No.81260627）

＊硕士研究生。研究方向：药物分析。E-mail：810347045@qq. com

#通信作者：教授，博士。研究方向：药物分析及新药研究。电话：0993-2057878。E-mail：Tanghuishz@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.23