蛋白激酶PLK4对人脑胶质瘤增殖的影响*

2017-08-14张作鑫周俊虎韩磊

中国肿瘤临床 2017年14期

张作鑫周俊虎韩磊

·基础研究·

张作鑫周俊虎韩磊

目的：分析蛋白激酶PLK4表达与胶质母细胞瘤患者预后相关性以及对人胶质瘤细胞增殖活性的影响。方法：基于CGGA数据库评估PLK4表达与胶质瘤患者病理级别和预后的关系；构建靶向PLK4基因的小分子干扰RNA，运用qPCR和Western blot法检测转染效率；利用MTT和平板克隆形成实验评价PLK4对肿瘤细胞增殖活性的影响。结果：PLK4的表达水平随样本病理级别的上升而增加，并且与胶质瘤患者总生存期和高级别胶质瘤患者的预后紧密相关；MTT和平板克隆形成实验结果显示敲低PLK4表达后肿瘤细胞增殖能力明显减弱。结论：PLK4的表达与胶质瘤患者的预后紧密相关，并能够影响肿瘤细胞的增殖活性。因此，PLK4可能是胶质瘤治疗的潜在靶点。

胶质瘤蛋白激酶 PLK4 增殖

PLK4是Polo样蛋白激酶家族中的一员，与该家族其他蛋白激酶不同，其羧基端仅有1个Polo结合域，该蛋白是调节中心粒扩增以及有丝分裂的1个关键因子［1］。研究表明，在正常增殖的细胞中，PLK4是一种处于低水平表达的丝/苏氨酸蛋白激酶，而在乳腺癌等许多肿瘤中，PLK4的活性明显异常［2］。PLK4蛋白的异常表达可能导致中心粒数目及结构的异常，从而导致肿瘤细胞有丝分裂能力的改变。同时，PLK4还可能是预测肿瘤患者预后的一个因子［3］。然而，PLK4在人脑恶性胶质瘤中的表达情况以及与患者预后的相关性尚不清楚。本研究基于CGGA患者样本数据库分析PLK4表达与胶质瘤患者病理级别及预后的相关性和RNAi敲低胶质母细胞瘤细胞系PLK4表达后分析肿瘤细胞增殖能力的变化，从而探讨PLK4与胶质瘤患者预后以及对肿瘤细胞增殖能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 胶质瘤样本数据库使用CGGA mRNA表达谱数据库（http：//www.cgcg.org.cn），其中患者标本Ⅱ级121例，Ⅲ级50例，Ⅳ级127例。分析不同级别患者组织样本中PLK4的表达情况，并根据PLK4的表达水平分析患者生存期并绘制Kaplan-Meier曲线。

1.1.2 主要试剂靶向PLK4的siRNA由苏州吉玛基因股份有限公司代为构建。序列1：5'-ACTCCTTTCAGA CATATAAG3'；序列2：5'-AACTATCTTGGAGCTTTATA A-3'；NC序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGC-3'。人脑恶性胶质瘤细胞系：U87、U251、LN229和人胚肾细胞均购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。U87Ⅷ细胞系为哈尔滨医科大学任欢教授馈赠，由本实验室常规培养；细胞培养所用的DMEM、MEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Thermo Fisher公司；Trizol RNA提取及转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；RT-qPCR系统试剂盒购自美国Promega公司；PLK4抗体购自美国Abcam公司；GAPDH抗体及辣根酶标记二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL检测系统及PVDF膜购自美国Milipore公司；MTT粉末、4%多聚甲醛、结晶紫染液、DMSO均购自北京索莱宝生物科技公司；细胞培养板购自美国NEST公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养U87、LN229、U87Ⅷ、HEK293T采用含10%胎牛血清的DMEM培养基、U251采用含10%的MEM培养基于37℃，5%CO2温箱培养。

1.2.2 实验分组阴性对照处理组（negative con⁃trol），siRNA序列1处理组（PLK4 RNAi 1#），siRNA序列2处理组（PLK4 RNAi 2#）。转染前1 d，取6孔板，每孔种植细胞2×105个/mL，过夜培养。待第2天细胞密度为70%～90%时，吸弃培养基，加入无血清培养基1 mL/孔，按照产品说明加入相应量转染试剂Lipo⁃fectamine 3000及siRNA，6 h后换新鲜含10%血清培养基继续培养，24～48 h后分析转染细胞。

1.2.3 qPCR法分析PLK4 mRNA表达水平采用Trizol法提取细胞总RNA，加入逆转录酶在42℃，60 min条件下进行逆转录形成cDNA，加入特异性PLK4基因引物，进行PLK4基因扩增实验，以GAPDH基因作为内参照。PLK4上游引物序列：5'-GACACCTCAGA CTGAAACCGTAC-3'；下游引物序列：5'-GTCCTTCT GCAAATCTGGATGGC-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'；下游序列：5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'。

1.2.4 Westernblot法测定PLK4蛋白水平的变化转染后细胞继续培养48 h后，用RIPA裂解液提取总蛋白，加热煮沸使蛋白变性，80 V下电泳90 min，冰浴中80 V转膜90 min。37℃封闭1 h，一抗4℃孵育过夜（1∶1 000），二抗室温孵育1 h（1∶2 000）。ECL检测系统根据产品说明书进行。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖将胶质瘤细胞以3×103/mL的密度接种于96孔板，每组细胞设8个复孔。根据Lipofectamine 3000产品说明书进行转染实验。37℃，5%CO2温箱孵育。从转染后第1天开始，以后每天固定时间取出96孔板，于相应孔中加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），共计5 d。37℃条件下再培养4 h，弃上清，加DMSO 150 μL/孔，摇床震荡20 min，酶标仪测490 nm波长各孔吸光值。

1.2.6 平板克隆形成实验转染后48 h，收集细胞、计数，以2×102/mL接种于6孔板，每组细胞设3个复孔，加入含血清培养基2 mL。37℃、5%CO2温箱孵育2～3周，每周固定换液。镜下观测到每个单克隆含有50个以上细胞时终止培养，以4%多聚甲醛固定30 min，加入结晶紫染液染色30 min，计数平板上各组细胞形成的肉眼可见的克隆数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 11.0软件进行统计学分析。图像分析应用Bandscan软件、采用方差分析、χ2检验进行分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤患者中PLK4的表达水平与患者病理级别和预后的相关性分析

通过对CGGA数据库中298例不同级别国人胶质瘤样本mRNA表达谱分析发现，PLK4 mRNA的表达水平与胶质瘤病理级别呈正相关；总体生存期分析发现，低表达PLK4的患者总生存期较高表达PLK4的患者明显延长（P＜0.000 1），并且在高级别胶质瘤患者中PLK4表达与患者预后明显相关（P＜0.000 1），但是在低级别胶质瘤患者中，PLK4表达与患者预后无显著性相关（P＞0.05，图1）。

2.2 不同胶质瘤细胞系PLK4 mRNA表达水平

应用qPCR方法对4种胶质母细胞瘤（glioblasto⁃ma，GBM）细胞系PLK4 mRNA表达水平进行了定量分析（图2）。与对照组（HEK293细胞系）相比，PLK4在U87细胞系中的相对表达量约为对照组细胞的4.42倍，在LN229、U251和U87Ⅷ细胞系中PLK4的相对表达量分别为对照组细胞的3.76、2.84和1.53倍。2.3qPCR检测RNAi后目的基因mRNA水平的表达

应用qPCR方法对U87、LN229细胞系PLK4 mRNA表达水平进行定量分析（图3）。U87细胞系中，与NC组相比，2个siRNA序列敲低PLK4表达后，PLK4 mRNA的相对表达量分别为对照组的0.54倍（RNAi 1#）和0.26倍（RNAi 2#）；LN229细胞系中，与NC组相比，2个siRNA序列敲低PLK4表达后，PLK4 mRNA的相对表达量分别为对照组的0.41倍（RNAi1#）和0.17倍（RNAi 2#）。

2.4 Western blot检测RNAi后目的基因蛋白水平的表达

Western blot实验结果显示，U87细胞系中，RNAi 1#处理组PLK4蛋白条带灰度值为NC组的0.35倍；RNAi 2#处理组PLK4蛋白条带灰度值为NC组的0.14倍；LN229细胞系中，RNAi 1#处理组PLK4蛋白条带灰度值为NC组的0.58倍；RNAi 2#处理组PLK4蛋白条带灰度值为NC组的0.35倍（图4）。表明与NC组细胞相比，两个RNAi处理组细胞中PLK4蛋白的表达量显著降低。

2.5 MTT实验

MTT分析结果发现，U87和LN229细胞系中，与NC组细胞相比，RNAi 1#和2#处理组细胞自第2天起增殖能力显著减弱（图5），且各组之间增殖速率的差异具有统计学意义（P＜0.05），表明敲低PLK4后肿瘤细胞增殖能力明显减弱。

2.6 平板克隆形成实验

平板克隆形成实验分析结果发现，U87细胞系中，NC组细胞形成集落51个，RNAi 1#处理组细胞形成集落30个，RNAi 2#处理组细胞形成集落17个；LN229细胞系中，NC组细胞形成集落70个，RNAi 1#处理组细胞形成集落30个，RNAi 2#处理组细胞形成集落24个，两种细胞形成集落能力明显低于NC组，差异具有统计学意义（P＜0.001），表明敲低PLK4后肿瘤细胞增殖能力明显减弱（图6）。

图1 CGGA数据库分析PLK4表达与胶质瘤患者病理级别和生存期的关系Figure 1Correlation of PLK4 expression with the survival of patients with glioma of different pathological grades was analyzed using the CGGA dataset

图2 利用qPCR检测不同胶质瘤细胞系中PLK4 mRNA的表达水平Figure 2PLK4 expression levels in different glio‐ma cell lines were measured by qPCR analysis

图3 qPCR法检测各处理组细胞PLK4基因mRNA水平的变化Figure 3PLK4 mRNA levels in several treated groups were determined by qPCR analysis af‐ter silencing PLK4 with siRNAs

图4 Western blot检测各处理组细胞PLK4基因蛋白水平的变化Figure 4PLK4 protein levels in treated groups were detect‐ed by Western blot analysis

图5 MTT法分析各处理组细胞的增殖活力Figure 5Proliferation of cells in treated groups was analyzed by MTT assay

图6 平板克隆实验检测各处理组细胞的增殖活力Figure 6Glioma cells were transfected with PLK4‐targeted siRNAs and subjected to colony formation assay to assess proliferation ability

3 讨论

蛋白激酶是一类能够催化ATP上的γ-磷酸转移到蛋白质分子中如丝氨酸、苏氨酸残基羟基、酪氨酸残基酚羟基等氨基酸残基上的磷酸转移酶。蛋白质的磷酸化及去磷酸化可以导致细胞生物信号的启动及传递，而细胞中信号异常通路转导及改变则可能导致肿瘤的发生及发展［4］。研究发现激酶与恶性胶质瘤的发生密切相关［5］，激酶还可以调节DNA甲基化［6］，组蛋白修饰［7］，染色质重构［8］，在胶质瘤的恶性进展中也发挥着重要的作用。PLK4是继PLK1-3发现之后又1个Polo样蛋白激酶，其定位于中心粒上，与中心粒的扩增有着密切的联系［9］。中心粒的稳定和正常复制在保持遗传的稳定性和协调联系细胞其他活动中起着关键作用［10］；细胞有丝分裂启动后，位于母中心粒上的PLK4蛋白激活，促使下游调控因子Sas-6、γ-tubulin、CEP-135、CP110等蛋白募集到母中心粒上完成中心体的组装，使中心体逐渐成熟［11］。通常情况下，在细胞周期G1/S转变期，以母中心粒为模板进行中心粒复制，在G2/M转变期，中心粒成熟，在有丝分裂前期，中心体逐渐移向细胞两极，随着细胞分裂，每个子代细胞获得一个中心体，从而完成有丝分裂。肿瘤细胞中经常发生中心粒结构与数目的异常，常常伴随着细胞分裂的缺陷与基因组的不稳定［12］。中心粒的异常可以导致染色体分裂紊乱，干扰细胞正常活动，导致肿瘤发生。Habedanck等［13］发现在骨肉瘤U2OS细胞中转染野生型PLK4后，细胞内中心粒数目＞2个，而转染催化失活型PLK4的细胞仅2个中心粒；用RNAi技术敲低人宫颈癌HeLa细胞中PLK4基因时，中心粒少于2个的细胞比例明显增多，由此推测抑制PLK4的活性可能会使细胞的增殖能力减弱。

本研究对中国人胶质瘤CGGA mRNA数据库分析发现，PLK4 mRNA的表达与胶质瘤级别呈正相关，并与胶质瘤患者和高级别胶质瘤患者的预后呈负相关。本研究还发现使用RNAi技术在胶质母细胞瘤细胞系中敲低PLK4表达后，通过MTT和克隆形成实验发现肿瘤细胞的体外增殖能力明显减弱，因此蛋白激酶PLK4可能是胶质瘤的潜在治疗靶点。但是PLK4被敲低后，引起恶性胶质瘤细胞增殖能力的下降所涉及的分子机制目前还鲜有报道，其是否通过参与肿瘤细胞中心粒扩增进而影响细胞周期进展和有丝分裂，及其与其他肿瘤生物学恶性表型的关系有待于进一步研究。

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（2017‐03‐15收稿）

（2017‐05‐11修回）

Effect of kinase PLK4 on the proliferation of glioma cells in vitro

Zuoxin ZHANG,Junhu ZHOU,Lei HAN

Lei HAN;E‐mail:superhanlei@hotmail.com
Department of Neurosurgery,Tianjin Medical University General Hospital,Lab of Neuro‐Oncology,Tianjin Neurological Institute,Key Laboratory of Post‐Neuro‐Injury Neuro‐Repair and Regeneration in Central Nervous System,Ministry of Education and Tianjin City,Tianjin 300052,China

Objective:To analyze the correlation of protein kinase PLK4 with the prognosis of patients with malignant glioma and the proliferation of human glioblastoma cells.Methods:The relationship of PLK4 expression to the pathological grade and prognosis was evaluated using CGGA datasets.Designated siRNAs targeting PLK4 were constructed,and the silencing effect was identified by RT‐qP‐CR and Western blot analyses.The effect of PLK4 on the proliferation of tumor cells was evaluated by MTT and colony formation as‐says.Results:The expression of PLK4 increased with pathological grade and was significantly related to the overall survival in patients with glioma and the prognosis of patients with high‐grade glioma.MTT and colony formation assay results indicated that the prolifera‐tion activity was significantly reduced after depleting PLK4.Conclusion:The expression of PLK4 is related to the prognosis of patients with glioma and can affect the proliferation activity of tumor cells.Therefore,PLK4 could be a potential therapeutic target in glioma treatment.

glioma,kinase,PLK4,proliferation