液相色谱—同位素质谱法鉴定蜂蜜掺假

陈亚威 张业鹏 范志勇

摘要 [目的]探讨液相色谱-同位素质谱法（LC-IRMS）技术在蜂蜜掺假鉴定中的应用效果。[方法]采用LC-IRMS法检测随机抽样的62个蜂蜜样品，对蜂蜜中果糖（Fru）、葡萄糖（Glu）、二糖和三糖δ13C值进行测定。[结果]由于真实蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖的δ13C的最大值与最小值的差值小于2.1‰，果糖、葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）为-1‰ ～1‰，且不得含有寡糖，所以该次检测样品中有48.38%的蜂蜜不合格，掺假掺杂以添加C-3 植物源转化产物和淀粉糖浆为主，应加强对这类掺假的监控管理。[结论] LC-IRMS实现了蜂蜜中各种糖组分如果糖、葡萄糖、二糖和三糖等δ13C的分离与分析，可进行添加了C-3糖浆的掺假鉴定，大大提高了蜂蜜掺假的检测能力。

关键词 液相色谱-同位素质谱；蜂蜜；掺假；δ13C值

中图分类号 S896.1；TS207.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）07-0009-02

Identification of Honey Adulteration by Liquid Chromatography-isotope Mass Spectrometry （LC-IRMS）

CHEN Ya-wei1，2， ZHANG Ye-peng1，2， FAN Zhi-yong2，3

（1.School of Mechanical Engineering， Hubei University of Technology， Wuhan， Hubei 430068；2.Key Lab of Modern Manufacture Quality Engineering， Wuhan， Hubei 430068；3.Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test， Wuhan， Hubei 430068）

Abstract [Objective] The aim was to explore application of LC-IRMS technique in identification of honey adulteration. [Method] We detected 62 honey samples by LC-IRMS， and determined δ13C value of fructose， glucose， disaccharide and trisaccharide of honey. [Result] The difference of maximum and minimum δ13C of fructose， glucose， disaccharide and trisaccharide of true honey was less than 2.1‰， and δ13CFru - δ13CGlu was from -1‰ to 1‰， and there was no oligosaccharides， so 48.38% of samples was no qualified. The adulteration was mainly C-3 plant products and starch syrup， so the monitoring management of adulteration should be strengthened. [Conclusion] LC-IRMS realizes the δ13C isolation and analysis of fructose， glucose， disaccharide and trisaccharide of honey， so it can be used in the adulteration identification of C-3 syrup and can improve the detection capability of honey adulteration.

Key words Liquid chromatography-isotope mass spectrometry （LC-IRMS）；Honey；Adulteration；δ13C value

蜂蜜是一種高品質的天然甜味剂，是由蜜蜂从花蜜或蜜露中生产出来的。蜂蜜主要含葡萄糖、果糖和蔗糖，还含有丰富的蛋白质、氨基酸、有机酸及多种维生素和矿物质等，特别含有多种活性酶类，如淀粉酶、蔗糖转化酶、过氧化氢酶和脂酶等。因此，蜂蜜是一种富有营养价值的天然食品[1]。近年来随着人民生活品质的提高，蜂蜜在国内外需求量不断增大。据统计，我国蜂蜜每年的销量远大于产量，蜂蜜掺假掺杂行为确实存在，尤以内销蜂蜜更为严重，且呈不断加重趋势。蜂蜜真实性鉴别成为当前急需解决的技术问题。

目前，测定蜂蜜掺假的主要方法有液相色谱示差折光检测法、薄层色谱法（TLC法）、糖类指纹图谱法、元素分析同位素比值质谱法和离子色谱法等[2]。对于目前市面上的掺假手段，如在蜂蜜中加入C-3或C-4植物糖浆，上述方法总有些局限性，耗时长、干扰多、灵敏度不高。

利用稳定同位素技术鉴定蜂蜜掺假问题越来越得到商检质检等检测机构的关注。随着稳定同位素比质谱技术的发展，以及连续流在线装置的集成化、多功能化和多样化，稳定同位素分析结果成为快速评鉴蜂蜜是否掺假的有力证据。液相色谱-同位素质谱法（LC-IRMS）采用液相色谱分离蜂蜜中的糖，测定蜂蜜中各种糖组分的δ13C值，测定结果与纯正蜂蜜中各糖组分的δ13C值做对比，用来鉴别蜂蜜的真假，提高了试验效率和灵敏度。笔者采用LC-IRMS对62个蜂蜜样品进行了检测，旨在为蜂蜜掺假监控与管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器。

DELTA V Advantage同位素质谱仪（Thermo Fisher公司）；UltiMate3000高效液相色谱仪（Thermo Fisher公司）与Isolink接口；Phenomenex Rezek RCM（Ca2+）色谱柱（300 mm × 8 mm，Thermo Fisher公司）；0.45 μm 水相滤膜。

1.1.2 试剂。

4% Na2S2O8溶液和4% H3PO4溶液；超纯水（Millipore公司）；He（高纯99.999%，载气）；CO2（工作标准参考气）；蔗糖标准品；δ13C标准品（Caffeine）水溶液。

1.1.3 样品。蜂蜜样品：来自日常抽检样品（共62个样）。

1.2 样品处理

称取0.5 g蜂蜜样品，用超纯水溶解，定容至50 mL，过0.45 μm水相滤膜到进样瓶中供液相色谱-同位素质谱仪测定。

同一蜂蜜样品分别配制成1、10 g/L蜂蜜稀释液，用于蜂蜜中果糖/葡萄糖δ13C和二糖/三糖δ13C的测定。

1.3 色谱和质谱条件

1.3.1 色谱条件。

色谱柱为Phenomenex Rezek RCM（Ca2+），洗脱剂为100%超纯水，流速为30 μL/min，样品溶液进样体积为10 μL，柱箱温度为70 ℃。Acid Pump（H3PO4）和Ox.-Pump（Na2S2O8）流速均控制在40 μL/min。

1.3.2 质谱条件。

氧化炉温度99.9 ℃；离子源：电子轰击离子源；轰击电压120.8 eV；扫描方式：正离子扫描；辅助气压力0.4 MPa；离子源电压2.97 kV；真空度2.0×10-4 Pa。进样品测定时，每个样品的分析起始阶段和尾气阶段通入CO2参考气进行系统稳定性评价。如果m/z 44信号在1～2 V或更低，则CO2的本底测试通过[3]。如果m/z 32信號在8～12 V，则O2的本底测试通过。

2 结果与分析

2.1 液相色谱-同位素质谱法分析蜂蜜样品中各类糖组分的δ13C值

如果蜂蜜是单一花种的纯正蜂蜜，其中含有果糖、葡萄糖、二糖和三糖的碳同位素值应十分接近。根据Elflein等[4]和Simsek等[5]的研究报道，真实纯蜂蜜样品各类糖组分的δ13C值在-28.2‰～-22.5‰，葡糖糖和果糖的δ13C值的差值为±1‰，果糖、葡萄糖、二糖和三糖的δ13C的最大值与最小值的差值小于2.1‰，果糖葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）为-1‰～1‰。

由表1可知，果糖葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）不在-1‰～1‰的有5、6、7、47号等9个样品，其中δ13C差值最小为2.4‰，最大为3.5‰，属于有掺假样品，这9个有掺假的样品经过其他方法提取时发现属于无蛋白或超低蛋白样品，由此判定若蜂蜜中无蛋白，那这种蜂蜜极可能为假蜂蜜。而蜂蜜中各种糖组分最大值与最小值的差值（δ13CMax - δ13CMin） < 2.1‰的有12、14、17、44、56等22个样品，也属于掺假样品，其中差值最大的达7.99‰，在这些样品中，还有15、17、18、44这4个样品检测出寡糖，而真实蜂蜜中是不得检出寡糖的[6]，所以这些样品都存在掺假掺杂。结果显示，检测样品中共有30个掺假样品，占62份蜂蜜样品总数的48.38%，并且凡是样品蜂蜜中果糖、葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）不合格的，各种糖组分的差值（δ13CMax - δ13CMin）也不合格；但蜂蜜中各种糖组分的差值（δ13CMax - δ13CMin）不合格的，果糖、葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）可能合格，也可能不合格[7]。说明目前的掺假手段大多是针对二糖、三糖甚至寡糖的掺假，也就是直接加入了C-3植物源糖浆来掺假。

2.2 LC-IRMS法在蜂蜜掺假中的检测应用

图1为使用LC-IRMS方法测定蜂蜜中各种糖组分的δ13C的离子流强度-时间图谱。蜂蜜试样中的各种糖组分经过HPLC在线分离和LC IsoLink湿化学氧化，转化为CO2，分别进行同位素比质谱分析，在谱图上均显示为尖峰。谱图上显示纯正蜂蜜中三糖在1 000 s附近出峰，二糖在1 100 s附近出峰，葡萄糖在1 300 s附近出峰，果糖在1 700 s附近出峰。

应用该方法检测来自7个不同企业共计62个抽检样品（生产日期在2015年12月至2016年6月）中，共有30个样品不合格，掺假占总数的48.38%；而利用已有的高效液相示差法分析蜂蜜中还原糖及蔗糖含量，结果显示只有3个样品不合格，占样品总数的4.84%；利用薄层色谱法（TLC法）测定蜂蜜中的高果淀粉糖浆，结果显示有16个样品不合格，占样品总数的25.81%。说明应用LC-IRMS法在蜂蜜中的掺假检出率远高于原有的方法。且这些企业对检测结果沒有提出申诉异议，说明该方法准确有效。

2.3 LC-IRMS法测定精度

在每次检测蜂蜜样品同时测定蜂蜜平行样品，测定62个蜂蜜平行样品各种糖组分的δ13C值，计算标准偏差。由表2可知，LC-IRMS方法测定蜂蜜中各种糖组分δ13C值标准偏差为0.1‰～0.4‰。二糖和三糖标准偏差比果糖、葡萄糖高些，是由于二糖和三糖在蜂蜜中含量相当低，所以要用10 g/L蜂蜜稀释液进行测定，而果糖、葡萄糖的含量相对高些，所以用1 g/L蜂蜜稀释液进行测定，同时温度、湿度、色谱分离效果、系统不稳定等因素也

存在造成偏差增大的可能性[8]。对于日常蜂蜜分析，LC-IRMS法完全可以满足蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值的测定。

3 结论

利用LC-IRMS法来检测随机抽样的62个蜂蜜样品，对蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值进行测定，结果发现30份存在掺假掺杂，占总数的48.38%。掺假手段大多是针对C-3植物源的葡萄糖、果葡萄糖浆甚至多种物质混合掺假，更具隐蔽性，同时突出该方法的优越性和准确性。掺假蜂蜜在市场上大量存在，形式多样，应加强监控和管理。

参考文献

[1] 费晓庆，吴斌，沈崇钰，等.液相色谱/元素分析 同位素比值质谱联用法鉴定蜂蜜掺假[J].色谱，2011，29（1）：15-19.

[2] 中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.蜂蜜中碳-4 植物糖含量测定方法稳定碳同位素比率法：GB/T 18932.1—2002[S].北京：中国标准出版社，2003.

[3] 丁涛.液相色谱-同位素质谱联用法在蜂蜜掺假鉴定方面的应用[C]//第四届华东地区色谱、质谱学术报告会论文集.无锡：江苏省分析测试协会，2010.

[4] ELFLEIN L，RAEZKE K P.Improved detection of honey adulteration by measuring differences between 13C/12C stable carbon isotope ratios of protein and sugar compounds with a combination of elemental analyzer-isotope ratio mass spectrometry and liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry （δ13C-EA/LC-IRMS）[J].Apidologie，2008，39（5）：574-587.

[5] SIMSEK A，BILSEL M，GREN A C.13C/12C pattern of honey from Turkey and determination of adulteration in commercially available honey samples using EA-IRMS[J].Food chemistry，2012，130（4）：1115-1121.

[6] PADOVAN G J，DE JONG D，RODRIGUES L P，et al.Detection of adulteration of commercial honey samples by the 13C/12C isotopic ratio[J].Food chemistry，2003，82（4）：633-636.

[7] 黃文誠.用不同的方法检测高果糖玉米糖浆掺假的蜂蜜[J].中国蜂业，2009，60（9）：51-52.

[8] 罗东辉，罗海英，冼燕萍，等.同位素质谱联用技术鉴别无蛋白蜂蜜的真实性[J].现代食品科技，2012，28（7）：862-866.