1—甲基乙内酰脲与氟尿嘧啶联合对人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡作用的研究

2017-08-12许云吉梁庆模

中国现代医生 2017年19期

许云吉　梁庆模

[摘要] 目的探讨1-甲基乙内酰脲（1-methylhydantoin）单用以及与氟尿嘧啶（5-Fu）联合对结肠癌SW480细胞增殖抑制作用和诱导凋亡。方法使用MTT比色法检测1-甲基乙内酰脲M（a-h）在不同浓度（0.5、5、10、20、50、100、200、500 mg/L）单用及与不同浓度5-Fu（a-d）（10、20、50、100 mg/L）联合作用于人结肠癌SW480细胞的吸光度值，然后再计算抑制率（IR）。流式细胞仪监测Md、Me、Fub、Md+Fub、Me+Fub处理SW480细胞48 h对细胞周期分布和凋亡影响。结果 1-甲基乙内酰脲在体外对人结肠癌SW480细胞有增殖抑制作用。在低濃度时，1-甲基乙内酰脲对人结肠癌SW480细胞增殖抑制效果与5-Fu相当（P>0.05）；在高浓度时，1-甲基乙内酰脲对人结肠癌SW480细胞抑制增殖效果弱于5-Fu（P<0.05）。1-甲基乙内酰脲与氟尿嘧啶联合应用有协同抗肿瘤效果。结论 1-甲基乙内酰脲能够抑制人结肠癌细胞SW480的增殖和诱导凋亡作用，并与氟尿嘧啶有协同抗瘤细胞增殖效果。

[关键词] 1-甲基乙内酰脲；结肠癌；MTT比色法；氟尿嘧啶；增殖抑制；诱导凋亡

[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）19-0036-04

[Abstract] Objective To investigate the proliferation inhibitory effect and inducingapoptosis of 1-methylhydantoin alone and combined application with 5-fluorouracil（5-Fu） on human colon cancer SW480 cells. Methods MTT colorimetric assay was used to detect the absorbance value of colon cancer SW480 cells after the application of different concentrations of 1-methylhydantoin（0.5， 5， 10， 20， 50， 100， 200， 500 mg/L） alone and combined application with 5-Fu（10， 20， 50， 100 mg/L）， and then the inhibitory rate was calculated.Flow cytometry was used to monitor the cell cycle distribution and apoptosis of SW480 cells treated with Md， Me， Fub， Md+Fub and Me+Fub for 48 h. Results 1-methylhydantoin had an inhibitory effect on the proliferation of human colon cancer SW480 cells in vitro. At low concentration， the inhibitory effect of 1-methylhydantoin on the proliferation of human colon cancer SW480 cells was similar to that of 5-Fu（P>0.05）； at high concentration， the inhibitory effect of 1-methylhydantoin on the proliferation of human colon cancer SW480 cells was weaker than that of 5-Fu（P<0.05）. Combined application of 1-methylhydantoin and 5-Fu had a synergistic anti-tumor effect. Conclusion 1-methylhydantoin can inhibit the proliferation and inducingapoptosis of human colon cancer cell SW480 and has a synergistic effect with 5-Fu.

[Key words] 1-methylhydantoin； Colon cancer； MTT colorimetric assay； Fluorouracil； Proliferation inhibition； Inducingapoptosis

恶性肿瘤严重威胁人类的生存健康，结肠癌就是其中之一，是仅次于乳腺癌、肺癌的恶性肿瘤。随着经济逐步发展，生活及精神压力不断增加，生活节奏日益加快，生活习惯改变，人口老龄化逐步加剧，饮食及膳食结构的变化，我国结肠癌患者的死亡率及患病率逐年递增。在临床治疗中，积极开发新的抗恶性肿瘤治疗药物及治疗手段意义深远。独角莲为我国独有的一味中草药，它具有抗惊厥、抗炎、抗破伤风毒素、调节免疫、抑制酪氨酸酶、杀菌、祛痰、增强免疫力等药理作用，近年来在抗肿瘤药物的研究中发现，独角莲及其提取物对乳腺癌、胃癌、原发性肝癌、肺癌等多种癌细胞具有增殖抑制效果[1-3]。1-甲基乙内酰脲是从独角莲中提取得到的[4]，研究证实，它具有良好的抗炎效果，是治疗免疫性疾病、炎症的有效活性成分，另外，1-甲基乙内酰脲还能抑制活化的淋巴细胞破坏内皮细胞、消除羟基自由基活性[5-6]。然而，1-甲基乙内酰脲抑制恶性细胞增殖和诱导凋亡作用的相关报道较少。本文旨在探讨1-甲基乙内酰脲对体外培养的SW480细胞增殖是否有抑制作用，以及对SW480细胞凋亡是否有诱导作用，同时与氟尿嘧啶的增殖抑制作用强弱相比较，以期为临床开发新的药物来治疗结肠癌。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠癌SW480细胞（中南大学湘雅医学院）；二甲基亚砜（DMSO）、RPMI-1640培养基、MTT粉、胰蛋白酶粉均购买于美国Sigma公司；1-甲基乙内酰脲（分子式C4H6N2O2，纯度>99.0%，分子量114.10）、5-氟尿嘧啶（上海旭东海普药业有限公司，批号：H31020593）；新生小牛血清（杭州四季清公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SW480细胞用RPMI-1640培养基（含有10%的新生小牛血清）培养在5% CO2、37.0℃、饱和湿度的培养箱中，细胞单层附壁生长，每2～3天传代一次，取对數期生长细胞用于实验。

1.2.2 实验分组根据预实验及文献资料[1-7]将实验分四组：1-甲基乙内酰脲组M（a-h）、Fu（a-d）组、对照组、1-甲基乙内酰脲和氟尿嘧啶联合组。对照组：加入培养基、SW480细胞、用生理盐水处理；乙内酰脲组（干预人结肠癌SW480细胞24 h、48 h、72 h）：浓度M（a-h）分别为0.5、5、10、20、50、100、200、500 mg/L；氟尿嘧啶组（干预48 h）：浓度Fu（a-d）分别为10、20、50、100 mg/L；联合组（干预48 h）：浓度分别为Fua+Mc、Fub+Md、Fuc+Me、Fud+Mf。MTT比色法测定各实验组对结肠癌SW480细胞株的抑制增殖效果，同时与单独使用氟尿嘧啶作用效果进行比较。Md、Me、Fub、Md+Fub、Me+Fub组干预人结肠癌SW480细胞48 h，流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率。

1.2.3 MTT比色法测定SW480细胞抑制率取对数期生长良好的SW480细胞用于实验；用0.25%胰蛋白酶消化液消化后制成单个细胞悬液，以每孔细胞5200个接种细胞于96孔培养板中，实验各组设置6个平行孔，培养至方案既定时间，用移液枪往培养板每孔中加20 μL 5 mg/L的噻唑氮蓝液，再培养4 h后终止细胞培养，将96孔培养板每孔内上清培养液用移液枪小心移除，用移液枪往每孔加150 μL二甲基亚砜，然后放在摇晃床上振荡10 min，使充分溶解，用酶标仪测定波长在570 nm下吸光度值（0D值）。细胞增殖抑制率=（1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值）×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡率按照《现代分子生物学实验技术》书中所述流式细胞技术方法稍加改动。将试验用细胞分别加入35 cm2细胞培养瓶中，每瓶20 mL细胞混悬液，按照实验制定计划加药处理48 h，对照组加入等量PBS，在北京康为世纪生物科技有限公司上机检测分析：所得数据采用Mod Fit LT for Mac V3.0软件进行分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，One Way ANOVA方式分析各组实验数方差，多组间均数采用SNK法进行比较，组间比较采用Students t检验，两组计量资料比较采用LSD法，以上步骤重复实验3次，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 1-甲基乙内酰脲对SW480细胞增殖抑制率的影响

见表1。1-甲基乙内酰脲在浓度5～500 mg/L浓度范围对体外培养的SW480 细胞株具有抑制增殖作用，两组比较差异显著（P<0.05）。1-甲基乙内酰脲在5～500 mg/L浓度范围内对结肠癌细胞增殖抑制率有浓度依赖性，1-甲基乙内酰脲对结肠癌SW480细胞增殖抑制率在5～500 mg/L范围内递增。1-甲基乙内酰脲作用48 h后抑制SW480细胞增殖作用最显著。

2.2 氟尿嘧啶、1-甲基乙内酰脲分别对SW480细胞株增殖抑制率的影响

见表2。浓度为10、20 mg/L的1-甲基乙内酰脲对结肠癌细胞的增殖抑制作用与等浓度氟尿嘧啶抑制效果相比，两者对结肠癌SW480细胞的增殖抑制效果相当，无显著性差异（P>0.05）。浓度为50、100 mg/L的1-甲基乙内酰脲对人结肠癌SW480细胞株的抑制作用与浓度为50、100 mg/L的氟尿嘧啶抑制作用相比，氟尿嘧啶对结肠癌SW480细胞增殖抑制作用大于1-甲基乙内酰脲，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.3 氟尿嘧啶和1-甲基乙内酰脲联用48 h对SW480细胞增殖抑制影响

见表3。与对照组对比，浓度在10～50 mg/L范围内氟尿嘧啶和1-甲基乙内酰脲联合应用对SW480细胞增殖抑制率有浓度递增趋势，随浓度增高联合用药对肿瘤细胞增殖抑制效果越明显，组间两两对比具有显著性差异（P<0.05）。浓度在100 mg/L时氟尿嘧啶和1-甲基乙内酰脲联用对结肠癌SW480细胞增殖抑制作用，与浓度为50 mg/L的氟尿嘧啶和1-甲基乙内酰脲联用对结肠癌SW480细胞增殖抑制作用相比效果相当，无显著性差异（P>0.05）。

2.4 氟尿嘧啶+1-甲基乙内酰脲联用与氟尿嘧啶单用对结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用

见表4。氟尿嘧啶与1-甲基乙内酰脲联用对SW480细胞增殖抑制作用强于相同浓度氟尿嘧啶单用，具有显著性差异（P<0.05）。氟尿嘧啶10 mg/L与1-甲基乙内酰脲10 mg/L联用组对结肠癌SW480细胞增殖抑制作用与氟尿嘧啶20 mg/L单用效果相当，差异无显著性（P>0.05）。5-Fu 50 mg/L与1-甲基乙内酰脲50 mg/L联用对结肠癌SW480细胞增殖的抑制效果强于氟尿嘧啶100 mg/L单独作用，具有显著性差异（P<0.05）。

2.5 1-甲基乙内酰脲、氟尿嘧啶对SW480细胞周期分布及细胞凋亡影响

随着浓度增高1-甲基乙内酰脲单用及与氟尿嘧啶联用使SW480细胞凋亡率逐渐上升，S期在细胞周期分布中所占百分比增大，两组间比较有显著性差异（P<0.05）。联合组干预SW480细胞凋亡率所占百分比较单独用药组高，联合组S期在细胞周期分布中所占百分比要比单独用药组高，两组间比较有显著性差异（P<0.05）。见表5。

3 讨论

独角莲中提取物种类众多，1-甲基乙内酰脲就是其中一种。研究证实，1-甲基乙内酰脲具有广阔的临床应用价值，风湿免疫性疾病、缺血再灌注、肺纤维化等多种疾病[8-9]治疗常用到1-甲基乙内酰脲，然而1-甲基乙内酰脲是否能抑制恶性肿瘤增殖以及是否能诱导恶性肿瘤细胞凋亡？迄今为止相关报道及研究较少。因此我们课题组推测在结肠癌抗癌治疗过程中使用1-甲基乙内酰脲有效果。

本文在体外采用MTT 比色法检测1-甲基乙内酰脲对体外培养的结肠癌细胞增殖抑制作用。结果显示，1-甲基乙内酰脲对体外培养的结肠癌细胞具有增殖抑制及诱导凋亡作用，且结肠癌细胞的抑制率呈剂量依赖趋势，结果与独角莲及其提取物抑制肿瘤细胞增殖的报道[2]相符合。但其对肿瘤细胞增殖抑制作用机制与肿瘤细胞的抑制效率、药物剂量、实验条件、实验对象等很多因素有关系，仍然需进一步研究探讨。

抗肿瘤药物作用的强弱常以传统药物氟尿嘧啶作为对照。1-甲基乙内酰脲对结肠癌SW480细胞的增殖有抑制作用以及1-甲基乙内酰脲可以诱导细胞凋亡已通过本实验研究证实。但和传统化疗药物相比，1-甲基乙内酰脲抗肿瘤作用效果如何？本研究选取同等剂量氟尿嘧啶作为参照，结果表明，1-甲基乙内酰脲在低浓度时对体外培养的SW480细胞抑制作用与氟尿嘧啶大致相等。1-甲基乙内酰脲在高浓度时对体外培养的SW480细胞抑制作用弱于氟尿嘧啶。本实验研究所得结果与独角莲醇提物在低浓度时抗恶性肿瘤增殖作用与氟尿嘧啶相比无显著性差异、独角莲醇提物在高浓度时抗恶性肿瘤增殖作用要弱于氟尿嘧啶的报道相符合[10-11]。所以1-甲基乙内酰脲具有非常好的抗恶性肿瘤价值，有必要进一步探讨研究。

抗癌药物单独使用容易使肿瘤细胞产生耐药性，且用药过程中具有较大的细胞毒副作用，为了增强抗肿瘤药物的效果，降低化疗药物的毒副作用以及避免肿瘤产生耐药性，临床上常使用多种药物联合抗癌治疗。氟尿嘧啶是临床上常用的抗癌药，在抗癌治疗过程中氟尿嘧啶常与其他抗癌药物联合应用，不但可以降低恶性肿瘤产生耐药性，还能增强抗癌药物的临床效果。1-甲基乙内酰脲具有良好的抗恶性肿瘤作用已被本试验研究证实，同时将氟尿嘧啶和1-甲基乙内酰脲联用的抗肿瘤作用与氟尿嘧啶单用进行比较。研究结果表明，氟尿嘧啶和1-甲基乙内酰脲联用抑制恶性肿瘤增殖作用要强于氟尿嘧啶单独使用。值得一提的是，氟尿嘧啶和1-甲基乙内酰脲联用抑制SW480细胞的增殖作用强于等浓度氟尿嘧啶单用，说明二者联合使用具有协同抗结肠癌细胞增殖和诱导凋亡作用。抗癌药物联合使用可以降低药物毒副作用，此结果与独角莲及其提取物抑制恶性肿瘤细胞增殖的研究报道相符[12-15]。因此需要进一步研究1-甲基乙内酰脲与其他抗肿瘤药物联合应用的临床价值。

本研究为1-甲基乙内酰脲单用及与传统抗癌药物联合应用抗肿瘤治疗提供了理论支持。但是1-甲基乙內酰脲抗恶性肿瘤细胞增殖作用研究目前还处于体外研究阶段，有必要开展移植瘤动物模型研究，为1-甲基乙内酰脲进入临床抗癌治疗奠定基础。

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