MICA基因多态性及单倍型多样性与卵巢癌的易感关联性研究

蒋丽琴，陈恩，王超

（1.南华大学附二医院 湖南 衡阳 421001；2.南华大学附一医院 湖南 衡阳 430400）

MICA基因多态性及单倍型多样性与卵巢癌的易感关联性研究

蒋丽琴1，陈恩2，王超1

（1.南华大学附二医院 湖南 衡阳 421001；2.南华大学附一医院 湖南 衡阳 430400）

目的探讨中国南方汉族人群MICA等位基因多态性和卵巢癌发生之间的关联。方法采用PCRSSP及PCR-SBT方法对外周血标本的目的基因进行检测。结果中国南方汉族卵巢癌组患者外周血标本中检测到11种MICA等位基因；和对照组相比较，MICA*010等位基因在卵巢癌组患者中分布频率升高。卵巢癌患者组中检测到5种MICA-STR等位基因，但其与对照组比较，差异无统计学意义；卵巢癌患者组MICA*010/010纯合子出现率增加，提示其对卵巢癌可能易感（＾OR=14.82，95%CI：1.89，115.94，P<0.05）。结论MICA等位基因多态性与中国南方汉族卵巢癌的发生有相关性。

MICA基因；基因多态性；卵巢癌

Abstract:ObjectiveTo study the association between theMICAgene polymorphism and haplotype diversity with the susceptibility of ovarian cancer.MethodsPCR-SSP and PCR-SBT were used to analyze the gene polymorphism and haplotype diversity of MICA in ovarian cancer patients and healthy individuals.ResultsEleven MICA allele genes were found in the south China ovarian cancer patients,and the frequency of MICA*010 was higher in south China ovarian cancer patients than in healthy controls,presenting genic susceptibility to ovarian cancer(O＾R=6.43,95%CI:3.51,11.76,P<0.05).Five MICA-STR alleles were detected,but there was no significant difference between the case and the control.Compared to the control group,the distribution frequency of MICA*010/010 was significantly high and it is probably a susceptibility genotype to ovarian cancer(O＾R=14.82,95%CI:1.89,115.94,P<0.05).ConclusionsMICAallele gene polymorphism and haplotype diversity may be associated with ovarian cancer.

Keywords:MICA alleles;gene polymorphism;ovarian cancer

卵巢癌（ovarian cancer，OC）患病率高，占妇科恶性肿瘤的23%，是导致成年女性死亡的常见疾病[1-2]。其预后差，目前没有早期诊断的方法，据报道，在已经确诊的患者中，超过60%患者有肿瘤细胞的盆腔和（或）远处转移，属于Ⅲ期或Ⅳ期晚期病例，因此早期预防十分必要[3]。卵巢癌的发病机制与多种因素有关，以往的研究表明，遗传背景也是其重要的发病原因之一。主要组织相容性复合物Ⅰ类链相关基因A（MHC class I related chain A，MICA）与人体免疫及肿瘤的发生息息相关，具有广泛的多态性[4]。20世纪末，由美国SPIES教授首先报道[5]。以往的研究表明，MICA基因与多种疾病发生有关联，尤其是肿瘤疾病，但暂无与中国南方人群卵巢癌患者易感性相关报道[6-8]。因此，本研究以卵巢癌患者作为研究对象，从MICA基因多态性这个角度观察其与中国南方汉族卵巢癌之间是否具有关联性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2012年9月-2015年10月在南华大学附二医院就诊并通过病理学等检查临床明确诊断为卵巢癌的患者；对其TNM分期不做限制；患者除卵巢癌外不能合并其他有遗传倾向的疾病。所有患者需在中国南方至少定居3代，且全部为汉族人群。招募到110例符合研究标准的患者，平均56.1岁（35～78岁）。招募124例健康志愿者，平均45.6岁（20～69岁），作为对照组。研究对象间无亲属关系。研究经南华大学附二医院伦理委员会审核，符合相关要求。

1.2 基因的提取及分型

参考相关文献，在外周血中提取DNA，对目标基因分型[9]。本研究采用序列特异性引物聚合酶链反应（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）与聚合酶链反应-直接测序分型（polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR-SBT）的方式[10-13]。PCR-SSP由设计的67个引物对组成。通过组合等方式，设计出不同基因型别所对应的不同组合方式，绘制出格局表（引物序列和格局表同参考文献[14]）；对每一标本进行68对PCR反应（其中一孔为阴性对照），每次反应都需加入内参；内参为人生长激素基因，引物序列如下，正向引物：5'-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3'；反向引物：5'-GAGAAAGGCCTGGAGGATTC-3'。产物长度 834 bp。

根据格局表可确立该标本的MICA等位基因型；根据MICA分型格局表对MICA基因的等位基因型别进行分析判断。将获得MICA等位基因的基因型别，采用Anthony Nolan Trust数据库查询获得MICA-STR型别。部分如MICA*002：01与MICA*020等的基因型别无法用PCR-SSP方法检出，也为验证PCR-SSP方法的可靠性，PCR-SBT方法对部分样本的MICA等位基因进行分型分析。扩增引物和测序引物参见文献[14]。

1.3 统计学方法

MICA等位基因频率、MICA基因型频率及遗传平衡检验（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）采用SHESIS软件进行计算获得[11]；等关联性分析用Logistic回归分析；采用Fisher精确概率法对其进行检验。P值采用Bonferroni校正后得到的Pc值在5%水平上进行检验[11]。

2 结果

2.1 两组Hardy-Weinberg平衡吻合度情况

经Hardy-Weinberg平衡吻合度检验分析表明，各等位基因的分布理论频率与观察频率之间差异无统计学意义，表明本实验所选样本是符合Hardy-Weinberg平衡的随机婚配群体。

2.2 MICA基因型确定

MICA基因扩增，扩增产物的电泳图（见图1），参照MICA分型格局表，判定该随机研究对象。MICA基因型为MICA*010/010。

2.3 PCR-SBT方法检测MICA基因

对研究对象基因组DNA扩增MICA的PCR产物（2.2kb）（见图2），每一泳道为1个个体的DNA样本。对样本经基因测序所显示的MICA基因（见图3）。

图1 MICA基因扩增产物电泳图

图2 随机标本MICA基因PCR结果

图3 某研究对象MICA基因

2.4 MICA基因与中国南方汉族卵巢癌之间的相关性

中国南方汉族卵巢癌患者中共检出11种MICA基因表型。其中，MICA*00201、MICA*010及MICA*019为最常见3种MICA表型，分别占20.90%、20.45%及19.55%。与健康对照组相比较，MICA*010等位基因在中国南方汉族卵巢癌组患者出现的频率增高（20.45%vs 6.05%），可能对卵巢癌易感（=6.42，95%CI：3.51，11.76，P<0.05）。见表 1。

2.5 MICA-STR基因与中国南方汉族卵巢癌之间的相关性

MICA-STR等位基因中国南方汉族卵巢癌组观测到5种，最高分布频率的是MICA-A5，占40.0%，与健康组比较，中国南方汉族卵巢癌组的分布频率差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.6 中国南方汉族卵巢癌相关性同MICA单倍型多样性的比较

对比结果显示，MICA*010/010纯合子基因型在中国南方汉族卵巢癌组中的出现频率与健康组对比增高（10.91%vs 0.82%），提示其可能为易感基因型（=14.83，95%CI：1.89，115.94，P<0.05）。见表 3。

表1 MICA各等位基因型频率比较

表2 MICA-STR各等位基因频率比较

表3 MICA各等位基因型频率比较

续表3

3 讨论

目前，在全世界范围内已有许多学者研究不同基因类型与卵巢癌发病机制的关系。黄娟等人[15]研究表明，卵巢癌发病风险与IL-6基因有一定关联；陈平平等人[16]研究发现，XRCC3基因与卵巢癌的发生存在相关性；李琰等[17]报告，MMP-12、13启动子区A/G型为卵巢癌易感因素；本研究表明，遗传条件对卵巢癌发病有明显的影响。

MICA基因存在广泛的多态性，许多疾病，如免疫系统疾病、肿瘤均与其有关[12-13，18]。本研究检测中国南方汉族人群卵巢癌患者及正常对照人群的MICA基因多态性，实验显示，有11种MICA等位基因在卵巢癌患者组被检测出，其中，MICA*00201、MICA*010和MICA*019是患者组中分布频率最高的3种MICA等位基因；与健康对照组相比较，MICA*010等位基因在中国南方汉族卵巢癌患者中出现的频率增高，MICA*010等位基因为中国南方汉族卵巢癌的可疑相关基因（=6.42，95%CI：3.51，11.76，P<0.05）。MICA-STR等位基因中国南方汉族卵巢癌组观测到5种，最高分布频率的是MICA-A5，占40.0%，与健康组比较，中国南方汉族卵巢癌组的分布频率差异无统计学意义（P>0.05）。以上结果表明，MICA等位基因与卵巢癌的发病有一定关联。由于MICA基因的产物能够与多种免疫细胞的细胞膜上的受体发生作用，从而是多种免疫细胞在抑制肿瘤的发生中发挥作用，故在本研究中，笔者推测可能是某些MICA基因的类型的个体，其MICA基因的生物学活力下降、产物不能很好地促进免疫细胞发挥抑制肿瘤发生的作用，从而导致最终卵巢癌的发生[11]。GAMBELUNGHE等发现，MICA-A5.1基因与SLE 的易感关系明显[11，19]，邢永华研究组报告MICA-A5.1基因与胃癌的发生有关[11，20]，同时可以观察到许多其他的病种也和MICAA5.1 基因相关[11，21-22]。本实验结果中，MICA-STR等位基因的分布频率在两组中无差异。引起该结果的原因可能有以下几点：①不同肿瘤细胞具有不同的特性，虽然该基因与其他疾病密切相关，但确实与卵巢的发生相关性不高[11]。②标本数量偏少，一种MICASTR型别包括多种等位基因，如MICA-A5.1包括MICA*008、MICA*23、MICA*28及MICA*054等位基因，需要更多的样本来反映该等位基因的分布规律。③MICA在卵巢癌细胞的生长过程中脱落[23-24]，产生所谓的肿瘤免疫逃逸现象[11]。

本研究选择的研究对象为中国南方汉族人群，以往的研究已经证实，MICA基因型会在各种人群表现出差异。因此，将来仍需选取其他不同人群作为研究对象，观察其他人群中，卵巢癌的发生与MICA基因多态性之间的关系，为将来了解卵巢癌的发生与不同基因型之间的关系打下基础。

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Association betweenMICAgene polymorphism and haplotype diversity with ovarian cancer

Li-qin Jiang1,En Chen2,Chao Wang1
(1.The Second Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China；2.The First Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 430400,China)

R392.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.010

1005-8982（2017）15-0047-06

2017-04-21

王超，E-mail：317249741@qq.com；Tel：13786404481