蝴蝶兰“双龙”品种离体叶片不定芽诱导的研究

王景君，吕清，裴冬丽*

(1.商丘市第一高级中学，河南 商丘 476000；2.商丘师范学院 植物与微生物互作重点实验室，河南 商丘 476000)



蝴蝶兰“双龙”品种离体叶片不定芽诱导的研究

王景君1，吕清2，裴冬丽2*

(1.商丘市第一高级中学，河南 商丘 476000；2.商丘师范学院 植物与微生物互作重点实验室，河南 商丘 476000)

以蝴蝶兰“双龙”品种的离体叶片为外植体，利用正交试验法研究MS基本培养基种类、TDZ、蔗糖3个因素及水平组合对蝴蝶兰离体叶片不定芽诱导的影响.结果表明：蝴蝶兰“双龙”品种诱导离体叶片不定芽产生的最佳培养基是1/2MS+0.3 mg/L TDZ+10 g/L蔗糖.

蝴蝶兰；组织培养；不定芽；叶片

蝴蝶兰，又名“洋王皇后”，具有很高的观赏价值.除此之外，蝴蝶兰还具有药用和食用价值，既能深加工研发出相关产品，又能做切花，组盆销售，是人们争相购买的年宵花之一，具有很大的经济效益和发展潜力.早期进行的蝴蝶兰组织培养是首先诱导花梗腋芽萌发，然后以丛生芽方式进行增殖[1].近年来，蝴蝶兰大多以原球茎途径进行繁殖，但是这种方式原球茎的诱导率较低，诱导时间长，尤其通过叶片诱导原球茎比较困难[2].有报道指出，蝴蝶兰叶片可以不经过原球茎阶段直接再生不定芽[3]，其发生时间短，诱导率高，且材料来源广.因此，本实验采用蝴蝶兰离体叶片不通过愈伤组织直接诱导不定芽的方式进行繁殖.MS培养基中的无机盐浓度较高,微量元素及有机成分齐全而丰富,对多数植物的增殖培养而言,是较为理想的一种基本培养基[4].对噻重氮苯基脲(thidiazuron,TDZ)已被成功用于多种植物的体外诱导不定芽形成和促进腋芽增生，特别是对难以诱导的木本植物其效果尤为明显[5].蔗糖是组织培养中最常用的碳源,在植物组织培养中,糖的用量不仅影响着培养物的生长速度和生长量,还影响其代谢水平、次生代谢物的合成以及细胞的形态和发生,是影响植物组织培养的关键因素之一[6].本实验主要研究MS基本培养基的种类、TDZ以及蔗糖的不同浓度对蝴蝶兰叶片诱导不定芽产生的影响，从而为高效诱导体系奠定一定的基础.

1 材料与方法

1.1 材料

蝴蝶兰“双龙”品种.

1.2 材料的处理

采用蝴蝶兰“双龙”品种无菌苗的离体叶片.挑选长势良好的无菌苗，于超净工作台上将其离体叶片切成0.5 cm×0.5 cm左右大小，上表面朝上置于培养基上.配置不同种类的诱导培养基，pH调至6.0，121 ℃灭菌20 min.前期暗处理15 d，后期转为光照培养(白天16 h，夜晚8 h)，培养温度为25 ℃.

1.3 蝴蝶兰不定芽组织的诱导

诱导蝴蝶兰不定芽组织的培养基选用(1/4～1)MS+(0～0.3) mg/L TDZ+(10～30) g/L蔗糖.选用基本培养基、TDZ、蔗糖3个参考因子，每个因子取3个水平，采用L9(34)正交表，因子水平安排见表1.每瓶5个叶片组织块，每个处理3瓶，试验重复3次.

表1 供试因素和水平

1.4 不定芽的继代培养

取蝴蝶兰不定芽长势良好，并由不定芽处生长出叶片的组织，将其进行继代培养，继代培养基为1/2MS.

1.5 不定芽的生根壮苗

将长势良好，无污染，分化程度较好的不定芽接入到生根培养基上，在25 ℃光照下培养，生根培养基为1/2MS+1 mg/L IBA.待其生根后，做壮苗处理，壮苗培养基为MS+1 mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D.

1.6 炼苗

将培养瓶中生长旺盛，长势优良的完整植株移栽到瓶外的培养土中，进行炼苗处理.首先将培养瓶拿到自然光下1-2 d，然后打开瓶盖5 d左右，将蝴蝶兰取出，在清水中将根部培养基清洗干净，栽入营养土和蛭石1∶1混合的基质中，定期浇水.

2 结果与分析

2.1 筛选诱导蝴蝶兰不定芽分化的最适培养基

蝴蝶兰离体叶片接种于培养基上(图1-A)，暗处理15 d内，叶片变黄，之后光照培养，叶片膨大，40 d后开始出现芽点(图1-B)，逐渐长出不定芽.叶片上长出的芽簇，嫩绿，饱满、生长迅速的为直接诱导出的不定芽(图1-C).

对于蝴蝶兰“双龙”品种，由表2的结果可以看出，蝴蝶兰叶片诱导不定芽的最适组合为A2B3C1，即1/2MS+0.3 mg/L TDZ+10 g/L蔗糖，诱导率达到33.3%.采用最小显著极差法分析各因子水平(表3)，可以看出最佳组合为A2B3C1，与表2结果一致.由于极差值越大，表示该因素越重要，由表3可以得出，在蝴蝶兰叶片诱导不定芽的3种因素中，起到重要作用的是TDZ和基本培养基，而蔗糖的影响次之.

表2 蝴蝶兰“双龙”品种叶片诱导不定芽正交试验表配比及诱导结果

表3 最小显著极差法的分析结果

2.2 不定芽的继代培养及生根、炼苗

挑选生命力强，嫩绿芽状，密集丛生的不定芽(图1-C)转接到继代培养基上进行继代培养，不定芽不断丛生，待其壮大后(图1-D)，转入到生根培养基上进行生根培养(图1-E)，使其长成完整植株，再进行扩繁.将培养瓶中生长旺盛的蝴蝶兰完整植株移栽到瓶外培养土中，进行炼苗处理(图1-F).

图1 蝴蝶兰离体叶片不定芽的发生以及试管苗形成与移栽A：接种后的叶片组织；B：切口处的芽点；C：叶片直接再生的不定芽；D：继代培养；E：壮苗和生根培养；F：炼苗.Fig.1 Adventitious bud occurrence of Phalaenopsis leaves test-tube seedling formation and transplantingA：The leaf tissues after inoculation; B：Bud points germination at the incision; C：Adventitious buds regenerated from leaves;D：Subculture; E：Strong seedling and rooting culture; F：Seedling adaptation.

3 讨 论

影响不定芽诱导的因素有很多，如基本培养基种类、pH值、激素种类和配比、蔗糖浓度、暗处理时间等.本实验通过正交试验法探究基本培养基种类、TDZ、蔗糖浓度对不定芽诱导的影响.采用最小显著极差法分析各因子水平可以看出，在蝴蝶兰叶片诱导不定芽的3种因素中，起到重要作用的是TDZ和基本培养基，而蔗糖的影响次之.TDZ对外植体分化有很大影响，是叶片不定芽发生所必需的条件[8].本实验中不添加TDZ的培养基均未诱导出不定芽，而添加了0.3 mg/L TDZ的培养基其诱导出不定芽的个数均比较多，说明TDZ在不定芽诱导中起决定作用，适宜浓度的TDZ可以提高诱导率.MS基本培养基不同的离子浓度对于不定芽的诱导有不同的影响，本实验结果表明，1/2MS是最为合适的基本培养基，这与前人的研究结果是一致的[7].作为组织培养的碳源，蔗糖最为合适，它能够维持一定的渗透势.本实验结果表明，对于蝴蝶兰“双龙”品种离体叶片不定芽的诱导最佳蔗糖浓度为10 g/L.有报道指出，暗培养对不定芽发生有显著的促进作用[9]，因此，本实验采用15 d暗处理培养.

本文通过选取不同的影响蝴蝶兰叶片不定芽生长的不同因子进行试验，从而筛选出蝴蝶兰离体叶片直接诱导不定芽产生的最适培养基.本研究表明，正交试验设计与数据分析方法对于研究植物生长物质与不定芽诱导的关系，以及选择最佳培养基，是十分有效的工具，其大大减少实验次数，节省了大量的人力、物力和财力[10].在蝴蝶兰组织培养中，利用叶片作为外植体不仅取材方便，而且可以简化诱导途径，提高组培扩繁的效率.本实验采用试管苗叶片作为外植体，降低了污染率，大幅提高了培养效率，为蝴蝶兰快繁提供了新途径.

[1]刘荣维,梅庆超,崔元方,等.丛生芽—蝴蝶兰无性快速繁殖的新途径[J].热带作物学报,1993,14(12)：105-107.

[2]李军,柴向华,曾宝,等.蝴蝶兰组培工厂化生产技术[J].园艺学报,2004,31(3)：413-414.

[3]李进进,廖俊杰,柯丽婉,等.蝴蝶兰根段的组织培养[J].植物生理学通讯,2000,36(1)：37.

[4]柳俊,谢从华.植物细胞工程(第2版)[M].北京：高等教育出版社,2011：33-36,84-86.

[5]Ma X F，Yu C M，Tang S W，et al.High frequency adventitious shoot induction and plant regenerationfrom hypocotyl of ramie[Boehmerianivea(L.)Gaud][J].Philipp Agric Scientist，2010，93(1)：121-125.

[6]范树国,江明,邱璐,等.激素和蔗糖浓度对蝴蝶兰愈伤组织诱导的影响[J].江苏农业科学,2010(3)：61-63.

[7]杨海芸,吴震,王广东,等.不同培养条件对蝴蝶兰离体叶片不定芽发生的影响[J].南京农业大学学报,2007,30(1)：44-49.

[8]杨美纯,周歧伟,许鸿源,等.外部因子对蝴蝶兰叶片原球茎状体发生的影响[J].广西植物,2000,20(1)：42-46.

[9]吴雪梅,汤浩茹,李燕,等.不同培养条件对“丰香”草莓离体叶片再生的影响[J].园艺学报,2004,31(5)：657-659.

[10]张国治,严霄,王凤仙,等.正交设计在组织培养研究中的应用[J].植物生理学通讯,1985,21(5)：46-48.

[责任编辑：徐明忠]

Phalaenopsis “ShuangLong” adventitious buds induction from leaves in vitro

WANG Jingjun1，LÜ Qing2，PEI Dengli2*

(1.Shangqiu First Senior High School，Shangqiu 47600，China； 2.Key Laboratory of Plant-Microbe Interactions，Shangqiu Normal University，Shangqiu 47600,China)

The effect of three factors and combination of the kinds of MS basic media，TDZ and sucrosewere studied on adventitious buds induction from leaves in vitro of phalaenopsis “ShuangLong” to be adventitious buds by using the orthogonal experiment design.The results showed that the optimal medium for the adventitious buds induction from leaves in vitro of Phalaenopsis “Shuang Long” is 1/2MS+0.3 mg/L TDZ+10 g/L sucrose.

phalaenopsis；tissue culture；adventitious buds；leaves.

2017-04-10

国家自然科学基金资助项目(31571997)；河南省高等学校重点科研项目(15A180019、15A210045、16A210037)

王景君(1983—)，女，河南民权人，商丘市第一高级中学教师，主要从事植物学的研究.

裴冬丽(1971—)，女，河南虞城人，商丘师范学院教授，博士，主要从事植物分子遗传学研究.

S682.32

A

1672-3600(2017)09-0039-04