葡萄糖激酶激动剂对胰岛α细胞胰升糖素分泌的影响

官滨斌， 刘礼斌



葡萄糖激酶激动剂对胰岛α细胞胰升糖素分泌的影响

官滨斌， 刘礼斌

目的 探讨葡萄糖激酶激动剂(GKA)对胰岛α细胞胰升糖素分泌的影响。 方法 (1)αTC1-9细胞株采用0，0.1及1 μmol/L的GKA处理，原代胰岛细胞用0，0.5及1 μmol/L的GKA处理，时间均为1 h，检测低糖刺激的细胞胰升糖素的分泌变化。(2)灌胃法给予SD大鼠0，3及30 mg/kg的GKA处理，分别观察0，15，30，60及120 min时SD大鼠体内血糖、血浆胰升糖素及胰岛素的变化。 结果 (1)αTC1-9细胞株经1 μmol/L的GKA作用1 h后，可显著降低低糖刺激的胰升糖素分泌，比对照组下降了45.16%。(2)原代胰岛细胞经0.5及1 μmol/L的GKA作用1 h后，可显著降低低糖刺激的胰升糖素分泌，分别比对照组下降了68.7%和84.3%。(3)GKA可剂量依赖性地降低SD大鼠的血糖水平，并可刺激大鼠体内胰岛素分泌；3及30 mg/kg的GKA可显著抑制SD大鼠体内的胰升糖素水平。 结论 GKA可抑制胰岛α细胞胰升糖素的分泌，从而改善糖代谢。

葡糖激酶； 葡萄糖/代谢； 胰岛/细胞学； 胰升糖素； 胰岛素

2型糖尿病是一种以持续性高血糖和脂代谢紊乱为特征的慢性进展性疾病，伴有大血管或微血管并发症。机体的血糖平衡是由神经及内分泌系统相互协调的结果，一旦平衡被打破便发展为糖尿病。葡萄糖激酶(glucokinase, GK)在维持机体的血糖平衡中发挥着重要作用。GK作为葡萄糖感受器，主要存在于肝细胞和胰岛β细胞，也存在于一些神经内分泌细胞，包括α细胞、肠上皮细胞、下丘脑、垂体及脑干的某些神经元细胞。GK基因已被发现大约有600多个突变。当编码GK的某个等位基因突变时，可引发2型青少年发病的成人型糖尿病；当编码GK的等位基因遗传性突变导致GK功能或表达丧失时，将导致GK相关的持续性新生儿糖尿病；当编码GK的基因突变使得体内GK活性异常升高时，将发生婴儿持续性高胰岛素低血糖症。因此，调节体内的GK活性可成为治疗糖尿病的一个新思路。

GK激动剂(glucokinase activators, GKA)可明显激活GK的活性，从而改善体内的高血糖状态。研究发现，GKA可减少氧化应激诱导的β细胞凋亡、增加肝糖原合成、减少肝脏葡萄糖输出以及增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌[1]。目前，关于GKA的研究主要集中于肝细胞和胰岛β细胞，但在2型糖尿病的发生发展过程中，还伴随着α细胞功能的紊乱，GKA是否可通过抑制胰岛α细胞分泌胰升糖素，从而参与降糖过程？本研究将为GKA治疗糖尿病提供理论基础和新的研发思路。

1 材料与方法

1.1 动物及细胞、试剂 清洁级8周龄健康雄性SD大鼠24只[许可证号：SCXK(沪)2003-0003，上海斯莱克实验动物有限责任公司]，体质量(200±25)g。小鼠αTC1-9(美国ATCC公司)；DMEM、1640细胞培养液(美国Gibco公司)；胰升糖素ELISA试剂盒(瑞典Mercodia公司)；胰岛素ELISA试剂盒(日本Shibayagi公司)；KRB溶液[NaCl 120、KCl 4.8、CaCl22.5、MgCl21.2、NaHCO33.24(单位：mmol/L)、BSA 1 mg/mL]；GKA药物粉剂(上海华领医药技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 GKA对αTC1-9分泌胰升糖素的影响 将αTC1-9细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液(16.7 mmol/L葡萄糖)的10 cm培养皿中，并置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞孵育箱中，5～7 d传代1次，待细胞长至70%～80%时，将细胞接种于24孔板。待细胞长至80%左右，用Hank’s液轻洗细胞2次，于37 ℃高糖KRB溶液(7 mmol/L葡萄糖)预培养30 min后，更换为低糖KRB溶液(1 mmol/L葡萄糖)，给予0，0.1及1 μmol/L的GKA(用GKA粉末溶解于低糖KRB溶液中)干预处理1 h，提取KRB溶液上清，-20 ℃保存，用ELISA法测定不同浓度组的胰升糖素水平。计算裂解细胞，检测蛋白含量，以校正胰升糖素(测得的胰升糖素浓度/蛋白浓度)。每个处理因素设2个复孔，实验重复3次。

1.2.2 GKA对原代胰岛细胞分泌胰升糖素的影响 胶原酶分离大鼠原代胰岛细胞，按照每孔20个胰岛的密度接种于24孔板中，培养于1640培养液(5.6 mmol/L葡萄糖，10% FBS)修复过夜，用Hank’s液轻洗细胞2次，37 ℃下给予高糖KRB溶液预培养30 min，更换为低糖KRB溶液，给予0，0.5及1 μmol/L的GKA干预处理1 h，其余步骤同1.2.1。

1.2.3 GKA对SD大鼠分泌胰升糖素的影响 SD大鼠18只，随机分成对照组、GKA(3 mg/kg)组及GKA(30 mg/kg)组(n=6)。大鼠饥饿6 h，采用灌胃法使大鼠服用GKA药物，并进行药物耐量试验，尾静脉采血，测定不同时间点(0，15，30，60及120 min)的血糖、血浆胰升糖素及胰岛素水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。两样本均数间比较采用t检验，三样本均数间的两两比较采用方差分析LSD-t检验，体内实验部分采用重复测量的方差分析。P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 GKA对αTC1-9细胞分泌胰升糖素的影响 在低糖(1 mmol/L)培养条件下，αTC1-9细胞胰升糖素的分泌量为高糖(7 mmol/L)条件下的1.98倍(P<0.05，图1A)。GKA(0.1 μmol/L)对αTC1-9细胞低糖刺激的胰升糖素分泌无明显影响，而GKA(1 μmol/L)可显著降低αTC1-9分泌低糖刺激的胰升糖素分泌，与GKA(0 μmol/L)比较，下降了45.16%(P<0.05，图1B)。

2.2 GKA对原代胰岛细胞分泌胰升糖素的影响 培养原代胰岛细胞后胰升糖素的分泌量，低糖条件下为高糖条件下的3.7倍(P<0.05，图2A)。GKA(0.5，1 μmol/L)可显著降低原代胰岛细胞分泌胰升糖素，与GKA(0 μmol/L)比较，分别下降了68.7%和84.3%(P<0.05，图2B)。

2.3 GKA处理后大鼠的药物耐量试验结果及胰升糖素、胰岛素分泌曲线变化 药物耐量试验结果显示，GKA可剂量依赖性地降低SD大鼠的血糖水平。GKA(3 mg/kg)组与对照组比较，灌胃后各时间点(15，30，60及120 min)血糖值差别无统计学意义；而GKA(30 mg/kg)组在给予药物灌胃30及60 min后的血糖值明显下降，与对照组比较，分别降低了26.76%和26.47%(P<0.05，图3A)。GKA(3及30 mg/kg)灌胃后，大鼠体内胰升糖素无明显的释放峰值出现(图3B)，与对照组比较，在给予GKA灌胃2 h后，GKA(3及30 mg/kg)组分别下降86.15%和89.23%(P<0.05)。胰岛素分泌曲线提示，GKA可刺激体内胰岛素分泌，分泌高峰为药物灌胃后15 min，此后逐渐减弱(图3C)。

GKA：葡萄糖激酶激动剂. A：与高糖组比较，☆：P<0.05；B：1 μmol/L的GKA组与0 μmol/L的GKA组比较，☆：P<0.05.图1 低糖及不同浓度GKA对αTC1-9细胞胰升糖素分泌的影响Fig 1 Effect of low glucose or various concentrations of GKA on glucagon secretion of αTC1-9

GKA：葡萄糖激酶激动剂. A：与高糖组比较，☆：P<0.05；B：不同浓度GKA组与未加GKA组比较，☆：P<0.05.图2 低糖及不同浓度GKA对原代胰岛细胞胰升糖素分泌的影响Fig 2 Effect of low glucose or various concentrations of GKA on glucagon secretion of primary islets

3 讨 论

1981年Unger提出了糖尿病发病的“双激素学说”，认为糖尿病发病是由于胰岛α细胞及β细胞功能均发生异常，即胰岛素分泌相对不足，胰升糖素分泌相对增高所致[2]。胰升糖素分泌的绝对或相对过多是造成2型糖尿病高血糖的重要原因；1型糖尿病患者内源性胰岛素分泌绝对不足，血中胰升糖素水平为正常人的10～15倍，且升糖效应也较正常人高出5～10倍。在糖尿病患者中，α细胞的功能存在明显异常，表现为低血糖时分泌反应不足，高血糖时分泌不适度的增多。在一项关于青少年1型糖尿病的研究中，餐后血糖与胰升糖素显著相关，血糖增加10 mmol/L可使胰升糖素相应增加20%[3]。此外，Ward等报道，与正常人比较，2型糖尿病患者的葡萄糖调节作用的敏感性下降，高血糖抑制胰升糖素分泌作用减弱，导致胰升糖素分泌持续增加，引起高胰升糖素血症，进一步刺激肝糖原分解，使血糖水平进一步升高，形成恶性循环[4]。血糖的稳定有赖于胰升糖素与胰岛素的相互协调。在2型糖尿病胰岛素分泌相对不足时，抑制胰升糖素仍可改善血糖。因此，阻断或减少胰升糖素的作用可作为糖尿病新的治疗靶点。

GKA：葡萄糖激酶激动剂. A：血糖；B：胰升糖素；C：胰岛素. 与对照组比较，☆：P<0.05.图3 不同浓度GKA对大鼠血糖、胰升糖素和胰岛素的分泌的影响Fig 3 Effect of various concentrations of GKA on blood glucose and glucagon or insulin secretion of rats

GKA作为一种降糖新药，对胰岛细胞及肝脏具有双重降糖作用，不仅可以增加胰岛β细胞对葡萄糖的敏感性，促进胰岛素的分泌，还可减少2型糖尿病患者肝糖原的分解[5]。许多GKA药物还显示出提高葡萄糖刺激胰岛素释放的优势，在动物实验中显示了显著的降糖效果[6]。之前关于GKA药物降糖机制的研究并未关注其对体内胰升糖素水平的影响。本研究发现，在体外实验中，GKA可抑制低糖刺激的αTC1-9细胞及原代胰岛细胞胰升糖素分泌；在体内实验中，GKA呈现剂量依赖性的降糖效应，同时可抑制SD大鼠血浆中胰升糖素水平，实验过程中胰升糖素未出现明显的释放峰值。提示GKA可降低体外细胞模型及体内动物模型的胰升糖素水平。笔者还观察到，在灌胃法给予SD大鼠GKA药物15～30 min时，其体内胰岛素水平显著提高，峰值出现于GKA灌胃后15 min。GKA药物与磺脲类药物相似，存在大剂量使用时出现的低血糖风险[7]。笔者将在后续的研究中进一步探索GKA药物是否同样可降低糖尿病大鼠模型的血糖，同时抑制其体内的胰升糖素水平。

目前，改善α细胞功能的降糖药主要有噻唑烷二酮类药物(thiazolidinediones,TZD)及人胰升糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)类似物，前者通过抗炎及抗氧化作用降低胰岛α细胞的胰岛素抵抗，从而改善胰岛α细胞分泌功能，而后者与二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4, DPP-4)抑制剂除上述的功能外，还具有改善胰岛α细胞功能、减少胰升糖素分泌的作用[8]。Takade等发现，小剂量注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)后，小鼠血中胰升糖素水平明显升高，免疫荧光染色见胰腺组织中胰升糖素和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)双阳性细胞较正常小鼠增加，而给予DDP-4抑制剂可降低血中胰升糖素的水平，还可使胰升糖素和PCNA双阳性细胞减少，提示DDP-4抑制剂可显著抑制STZ小鼠胰岛α细胞的增殖和分泌功能[9]。GKA是否可通过抗炎、抗氧化作用减轻胰岛α细胞的胰岛素抵抗或通过抑制胰岛α细胞增殖及其分泌功能，从而改善胰岛α细胞功能，仍有待进一步明确。

目前GKA作为抗糖尿病的新药已进入临床试验阶段[10-12]。本研究提示，GKA可抑制体内及体外低糖刺激的胰升糖素水平，是对GKA药物降糖机制的补充。胰岛α细胞功能障碍在糖尿病的发生、发展过程中发挥不可忽视的作用，改善胰岛α细胞的功能应该成为治疗糖尿病的一个重要环节。推测GKA药物可改善机体糖代谢的部分原因与其能改善胰岛α细胞的功能有关，尽管目前具体作用机制尚未明确，相信随着对GKA类药物作用机制研究的深入，将突破传统药物只改善胰岛β细胞的局限性，为糖尿病的治疗开辟新的领域。

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(编辑：何佳凤)

Effect of Glucokinase Activators on α-cell Glucagon Secretion

GUAN Binbin, LIU Libin

Department of Endocrinology, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

Objective To investigate the effect of glucokinase activators(GKA) on α-cell glucagon releasing. Methods (1) αTC1-9, an α cell line, were incubated with different concentration of GKA(0, 0.1, 1 μmol/L)for 1 h，then the secretion of glucagon stimulated by low glucose were measured. (2) Primary islets were incubated with different concentrations of GKA(0, 0.5, 1 μmol/L)for 1 h，then the secretion of glucagon stimulated by low glucose were measured. (3) SD rats were treated with different concentrations of GKA by intragastric administration, then the blood glucose, plasma glucagon and plasma insulin were detected. Results (1) Exposure of αTC1-9 to GKA(1 μmol/L)for 1 h resulted in a reduction of glucagon secretion, and compared with control group it was reduced by 45.16%. (2) After treated with GKA (0.5, 1 μmol/L)for 1 h，the levels of glucagon in both groups of primary islets were reduced significantly, and compared with control group it was reduced by 68.7% and 84.3%, respectively. (3) The reduction effect of GKA on blood glucose in SD rats was dose dependent. In both the low dose treatment group(GKA 3 mg/kg)and high dose treatment group(GKA 30 mg/kg), plasma glucagon levels were significantly reduced. GKA stimulated insulin secretion in SD rats. Conclusion GKA may improve glucometabolism, which may be due to the inhibition of glucagon secretion.

glucokinase; glucose/metabolism; islets of langerhans/cytology; glucagon; insulin

2016-10-19

福建省自然科学基金卫生联合资金项目(2016J01547)

福建医科大学 附属协和医院内分泌科，福建省内分泌研究所，福州 350001

官滨斌，男，住院医师，医学博士

刘礼斌. Email:Libin.liu@hotmail.com

R-332； R322.57； R343.23； R345.57 ；R587.1； R977.3； R977.7

A

1672-4194(2017)03-0155-04