不同培养条件对蓝莓试管苗增殖生长的影响

尹利方，陈泽斌,2*，夏体渊**，靳 松，李育川，任 禛，张瑜瑜，李静雯

(1.昆明学院农学院，云南 昆明 650214；2.云南省高校特色生物资源开发与利用重点实验室，云南 昆明 650214)



不同培养条件对蓝莓试管苗增殖生长的影响

尹利方1，陈泽斌1,2*，夏体渊1**，靳 松1，李育川1，任 禛1，张瑜瑜1，李静雯1

(1.昆明学院农学院，云南 昆明 650214；2.云南省高校特色生物资源开发与利用重点实验室，云南 昆明 650214)

【目的】加快蓝莓品种“康维尔”组培苗快繁速度。【方法】以“康维尔”茎段为外植体，研究了不同pH梯度、不同蔗糖浓度梯度以及3种结构相似的细胞分裂素对蓝莓试管苗增殖的影响。【结果】pH 6.0时的鲜重和增殖系数都最高，说明蓝莓品种“康维尔”最适宜的酸碱度为6.0；当蔗糖浓度为25 g/L时，试管苗鲜重达到最大值，不再随蔗糖浓度增加而增加，蔗糖浓度25～30 g/L的增殖系数和苗高都无显著差异，因此出于成本的考虑，可选择25 g/L作为生产上使用的蔗糖浓度；使用反玉米素核苷的试管苗无论是在鲜重、增殖系数和苗高都明显高于反玉米素和玉米素，且使用反玉米素核苷的成本更低。【结论】蓝莓“康维尔”试管苗的最佳增殖培养基：LM基本培养基 + 25 g/L蔗糖 + 1 mg/L反玉米素核苷，pH 6.0。

蓝莓；组织培养；增殖

【研究意义】蓝莓，又称越桔或蓝浆果，属于杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)植物，多年生落叶或常绿灌木，原产于北美。全世界约400个种，中国蓝莓栽培起步较晚，自20世纪80年代初，有关单位先后从国外引进100多个蓝莓品种，并进行了栽培和育苗研究，分为兔眼蓝莓、高丛蓝莓、矮丛蓝莓3个类别，主要分布于东北和西南地区[1]。蓝莓果中含有花色素苷、黄酮等多种多酚类生理活性物成分，联合国粮农组织将蓝莓列为人类五大健康食品之一[2-3]。蓝莓的常规繁殖方法较多，有种子育苗、绿枝扦插、硬枝扦插、根插和分株嫁接等，但繁殖系数低，生长速度慢，品种易退化。【前人研究进展】利用组织培养的方法可以在短期内大大提高繁殖系数，缩短繁殖时间，并且可以保持品种的优良特性，现己成为近年来众多学者研究的热点之一[4-10]。目前蓝莓离体快繁技术已较为成熟，但蓝莓品种繁多且更新换代较快，已发现不同基因型蓝莓品种对培养条件的要求不同，培养条件不同，培养获得的试管苗的健壮程度及增殖倍数有所不同[11-13]。饶宝蓉[11]研究发现改良WPM培养基 + ZT 1.25 mg/L + 蔗糖40 g/L + 卡拉胶6.5 g/L，pH 5.2的培养条件下，蓝莓“夏普蓝”组培苗丛生芽分化效果最佳；李丽容[12]研究发现兔眼蓝莓增殖培养以WPM培养基 + ZT 1.0～1.5 mg/L + 蔗糖30 g/L + 琼脂6.8 g/L，pH 5.0～5.2的培养基效果较好；廉家盛[13]研究认为B5培养基 + ZT 1.25 mg/L + 蔗糖30 g/L + 琼脂7.0 g/L，pH 5.4时蓝莓“美登”分化的芽数最多。【本研究切入点】关于结构相似的分裂素在组培中的应用效果研究鲜见报道，国内唯有张力思[14]研究认为，WPM培养基添加玉米素增殖效率略高，添加反玉米素居中，而添加反玉米素核苷相对较低，同时发现，在相同条件下，蓝莓品种间的差异较大，“塞艾罗”增殖系数较高，“乔治亚姆”较低。“康维尔(Coville)”是昆明学院农学院与北京农学院合作开展蓝莓试管苗工厂化生产的品种，关于该品种蓝莓组培快繁体系的研究目前尚未见报告。前期已优选出最佳培养基LM[15]。【拟解决的关键问题】为了进一步提高生产效率，并降低生产成本，本试验增殖培养蓝莓品种“康维尔”试管苗的带叶茎段，比较了不同pH梯度、不同蔗糖浓度梯度以及3种结构相似的细胞分裂素对蓝莓试管苗增殖的影响，试图优选出适于“康维尔”试管苗增殖的条件，推动“康维尔”试管苗的大规模生产，同时也为进一步研究3种细胞分裂素的作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 蓝莓品种及增殖培养基

蓝莓品种“康维尔(Coville)”试管苗由云南省都市特色农业工程技术研究中心植物组织培养实验室提供。以带叶茎段作为继代培养的无性繁殖材料，LM基本培养基由昆明学院农学院和北京农学院共同研制[15]，成分见表1。

1.2 不同pH对试管苗增殖生长的影响

LM培养基配制好后添加玉米素(Zeatin)1 mg/L、蔗糖20 g/L、琼脂6.2 g/L，pH分别调至6.0、5.5、5.0、4.5，培养基在121 ℃、131 kPa的条件下灭菌20 min。

1.3 不同蔗糖浓度对试管苗增殖生长的影响

LM培养基配制好后添加玉米素(Zeatin)1 mg/L、蔗糖浓度分别添加至30、25、20、15 g/L、琼脂6.2 g/L，pH调至5.5，按1.2方法灭菌。

1.4 不同细胞分裂素对试管苗增殖生长的影响

LM培养基配制好后分别添加玉米素(Zeatin)、反玉米素(Trans-Zeatin)、反玉米素核苷(Trans-zeatin Riboside)1 mg/L、蔗糖20 g/L、琼脂6.2 g/L，pH调至5.5，按1.2方法灭菌。

1.5 增殖培养

无菌条件下将同代生长情况整齐一致的“康维尔”组培苗丛生芽切成2 cm的带叶茎段，分别接入1.2、1.3、1.4的培养基，每处理接种25瓶，每瓶接种6个茎段，每5瓶为1个重复，每处理重复5次。培养温度25 ℃，光照强度3000 lx，光周期为16 h光照/8 h黑暗。在第30天时调查每处理的鲜重、增殖系数、苗高，并以单株为单位统计。增殖系数=新枝总数(≥2 cm)/接种茎段数。

1.6 数据分析

采用WPS表格软件对试验数据进行基本整理，采用DPS 6.50统计分析软件对实验数据进行方差分析和Duncan’s新复极差检验。

2 结果与分析

2.1 不同pH对试管苗增殖生长的影响

由表2可见，在pH 4.5～6.0时，试管苗的鲜重及增殖系数都随着pH的升高而升高，其中pH 6.0的鲜重和增殖系数都最高，但与pH 5.5的鲜重及增殖系数无显著差异，pH 5.5与pH 5.0的鲜重及增殖系数无显著差异，pH 4.5的鲜重及增殖系数最低，与其他pH相比差异显著；苗高随着pH的升高而升高，但处理间差异不显著；说明在pH 4.5～6.0时，不同酸碱度的培养基对苗高的影响不大。

2.2 不同蔗糖浓度对试管苗增殖生长的影响

由表3可见，在蔗糖浓度15～25 g/L时，鲜重随着蔗糖浓度的增加而增加，当蔗糖浓度为25 g/L时，鲜重达到最大值，不再随蔗糖浓度增加而增加，且与蔗糖浓度30 g/L的鲜重无显著差异；在蔗糖浓度15～30 g/L时，增殖系数随着蔗糖浓度的升高而升高，但20、25、30 g/L之间的增殖系数无显著差异，15 g/L的增殖系数最低，与其他蔗糖浓度的增殖系数差异显著；苗高随蔗糖浓度的升高而增加，25和30 g/L的苗高无显著差异。

2.3 不同细胞分裂素对试管苗增殖生长的影响

由表4可知，使用反玉米素核苷的试管苗鲜重、增值系数和苗高都最大，与使用玉米素和反玉米素的试管苗相比差异显著；使用玉米素的试管苗鲜重、增值系数和苗高都略低于反玉米素处理，两处理间鲜重、增值系数和苗高无显著差异。

表1 LM培养基配方

2.4 添加不同细胞分裂素的成本核算

不同细胞分裂素购于合肥博美生物科技有限责任公司，品牌都为Ruibio，级别都为高纯级，由表5可看出虽然每25 mg反玉米素核苷的价格相对玉米素、反玉米素高了19.00元，但由于使用反玉米素核苷的试管苗增值系数高，所以每增殖培养1株的成本为0.0024元，比使用玉米素和反玉米素的成本都低。

表2 不同pH对试管苗鲜重、增殖系数和苗高的影响

注：数据后不同小写字母表示在α=0.05水平上差异显著，下同。

Notes: Values followed by the different letter are significantly different (α= 0.05) on the basis of Duncan’s multiple range test. The same as below.

表3 不同蔗糖浓度对试管苗鲜重、增殖系数和苗高的影响

表4 不同细胞分裂素对试管苗鲜重、增殖系数和苗高的影响

表5 增殖培养基中添加不同细胞分裂素的成本

3 讨 论

在植物离体快繁中，pH、蔗糖浓度、植物生长调节剂的种类和浓度，以及培养基的组成都会影响组培苗的生长与分化。蓝莓离体茎段发生的不定芽增殖率与培养基中添加的生长调节剂种类和浓度密切相关。从不同pH对试管苗增殖生长的影响来看，试管苗的鲜重及增殖系数都随着pH的升高而升高，其中pH 6.0的鲜重和增殖系数都最高，说明pH 6.0是蓝莓品种“康维尔”组培最适宜的酸碱度。

在植物组织培养中，糖类不仅为培养物提供能量，而且是培养物渗透环境的主要调节者。器官的发生是一个需要高能的过程。因此，在培养基中不断提供糖源是不定芽形成所必需的。一般比较常用的作为碳源的糖种类主要有果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇等，其中蔗糖一直被广泛应用，作为标准碳源。过低或过高的糖浓度，都可能因为外植体失水对细胞的生命活动产生不良影响。因此，糖的种类不仅影响培养物的生长速度和生长量，而且影响代谢水平、次生代谢物合成、以及细胞的形态和发生，是影响植物组织培养成功与否的关键因素之一。从不同蔗糖浓度对试管苗增殖生长的影响来看，当蔗糖浓度为25 g/L时，鲜重达到最大值，不再随蔗糖浓度增加而增加，说明在蔗糖浓度25～30 g/L时，蔗糖浓度的改变对鲜重的影响不显著，而从增殖系数来看，蔗糖浓度25、30 g/L之间的增殖系数无显著差异；从苗高来看，25和30 g/L的苗高无显著差异，因此出于成本的考虑，可选择25 g/L作为生产上使用的蔗糖浓度。

植物组织培养过程中所使用的培养基成分对外植体的影响较大，从理论上来说甚至决定了培养体系建立的成败[16]，而培养基中所使用的激素种类及浓度是其关键因素。探讨不同激素种类、不同浓度及其优化组合仍然是植物组织培养工作者们关注的课题，这对相关的基础理论研究和生产实际应用具有重要意义。3种细胞分裂素的主要生理功能类似，在植物体内的主要作用是促进细胞的分裂和器官分化、抑制顶端优势、促进侧芽的生长等，从不同细胞分裂素对试管苗增殖生长的影响来看，使用反玉米素核苷的试管苗无论是在鲜重、增殖系数和苗高上都要明显高于反玉米素和玉米素，且使用反玉米素核苷的成本更低，因此在生产上，可考虑使用反玉米素核苷代替玉米素或反玉米素。

4 结 论

本试验在前期已优选出最佳培养基LM的基础上，增殖培养蓝莓品种“康维尔”试管苗的带叶茎段，比较了不同pH梯度、不同蔗糖浓度梯度以及3种结构相似的细胞分裂素对蓝莓试管苗增殖的影响，认为生产中，蓝莓“康维尔”试管苗的最佳增殖培养基：LM基本培养基 + 25 g/L蔗糖 + 1 mg/L反玉米素核苷，pH 6.0。

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(责任编辑 王家银)

Effect of Different Culture Conditions on Blueberry Shoot Propagation

YIN Li-fang1, CHEN Ze-bin1,2*, XIA Ti-yuan1**, JIN Song1, LI Yu-chuan1, REN Zhen1, ZHANG Yu-yu1, LI Jing-wen1

(1.Agriculture College, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China; 2.Key Laboratory of Special Biological Resource Development and Utilization of Universities in Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China)

【Objective】 The objective of this study is to establish a high efficient rapid propagation of tissue culture seeding of blueberry ‘Coville’. 【Method】 The effects on proliferation of blueberry plantlet in vitro of different pH-gradients, different sucrose concentration and three structurally similar kinds of cytokinin were studied. 【Result】 The fresh weight and the proliferation coefficient of pH 6.0 were the highest, which meant the most suitable pH value of ‘Coville’ was 6.0. When the sucrose concentration was 25 g/L, the fresh weight reached a maximum which didn’t increase with the increase of sucrose concentration any more. The proliferation coefficient and the fresh weight had no significant differences when the sucrose concentration was between 25-30 g/L. Using trans-zeatin riboside could get higher proliferation coefficient, fresh weight and seedling height than using zeatin and trans-zeatin, and the cost of using trans-zeatin riboside was lower than the others.【Conclusion】The optimum medium for the multiplication of plantlet of blueberry ‘Coville’: LM basic medium + sucrose 25 g/L + trans-zeatin riboside 1 mg/L, pH 6.0.

Blueberry; Tissue culture; Propagation

1001-4829(2017)7-1642-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.030

2016-09-10

云南省都市特色农业工程技术研究中心项目(TSNY0201)；云南省教育厅科学研究基金项目(2014Y390)；云南省应用基础研究青年项目(2013FD040)；昆明学院人才引进项目(YJL14005)；昆明学院人才引进基金项目(YJL12010)；昆明学院校立重点基金项目(XJL12020)；昆明学院大学生科研项目(XJD16081)；云南中烟品牌省内原料产地生态与主栽品种合理布局研究项目；云南省高校优势特色重点学科(生态学)建设项目资助(05000511311)；云南省特色生物资源开发与利用重点实验室开放基金项目(GXKJ201621)；昆明市农业局滇池流域农业面源污染综合防控对策研究(2016JC01)

尹利方(1981-)，女，云南昆明人，硕士，讲师，主要从事都市农业的教学科研工作，E-mail: 563454379@qq.com,*为共同第一作者，E-mail: zbchenkmu@163.com,**为通讯作者，E-mail: xiatiyuan@sohu.com。

S663.9

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