滇重楼茎秆软腐病病原鉴定

马维思,杨 斌，严世武，王 馨，董志渊，李林玉，张新华，杨丽英*

(1.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650205；2.大理州农业科学推广研究院，云南 大理 671005)



滇重楼茎秆软腐病病原鉴定

马维思1,杨 斌1，严世武1，王 馨1，董志渊1，李林玉1，张新华2，杨丽英1*

(1.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650205；2.大理州农业科学推广研究院，云南 大理 671005)

【目的】明确滇重楼茎秆软腐病的病原，以期为该病的防治提供依据。【方法】通过田间调查采样，初步掌握滇重楼茎秆软腐病的发生规律，通过稀释分离、柯赫氏法则验证获得病原菌，基于形态特征和16S rDNA、gyrB、rpoB基因序列特征对病原菌进行鉴定。【结果】从发病植株上分离出1株细菌，经柯赫氏法则验证为滇重楼茎秆软腐病病原菌，基于形态和分子生物学特征将其鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum。【结论】胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种P.carotovorumsubsp.carotovorum是滇重楼茎秆软腐病的病原菌。

滇重楼；茎秆软腐病；病原鉴定；胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种

【研究意义】滇重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz是百合科重楼属多年生草本植物，主要分布在中国的云南、四川、贵州以及缅甸北部等地[1]，是2015年版《中华人民共和国药典》规定的2种重楼基源植物之一，主要用于疔疮痈肿，咽喉肿痛，蛇虫咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐[2]，是“云南白药”、“宫血宁”、“季德胜蛇药”等药品的主要成分之一[3]。【前人研究进展】由于野生资源稀缺，近年来以云南省为主开展了大量有关滇重楼人工栽培技术的研究推广，据李恒等2015年报道，云南境内人工种植的滇重楼面积已达1333.33 hm2[4]。【本研究切入点】目前，一种未见报道的茎秆软腐病在云南丽江、大理、楚雄、昆明、红河等滇重楼主要产区出现，局部地块发病严重，造成生育期的滇重楼植株茎秆腐烂、植株倒伏，由于对该病还缺乏了解，尚无有效的防治方法，该病已对滇重楼种植形成较大威胁。【拟解决的关键问题】本研究对滇重楼茎秆软腐病的发生特点进行调查，并对病原菌进行分离鉴定，以期为该病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

滇重楼茎秆软腐病病株于2014年7月采自云南大理云龙，经云南省农业科学院药用植物研究所杨斌副研究员鉴定为滇重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz。

肉汁冻培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，琼脂粉17 g，水1000 mL[5]。

主要试剂：Omega D3350细菌DNA小量提取试剂盒购自广州飞扬生物工程有限公司；2 X PCR Master(Taq，染料)即用PCR扩增试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，分别是细菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[6]，rpoB基因引物rpoBup(5′-GACATCGACCACYTSGGCAACC-3′)、rpoBlow(5′-ACGGCCTGACGYWKCATGTTCG-3′)，革兰氏阴性菌gyrB基因通用引物Up-1G-(5′-YGCSGGCGGYAAGTTCGA-3′)、UP-2G-(5′-CCRTCGACGTCVGCRTCGGT-3′)[7]。

1.2 方法

1.2.1 田间病害调查 2013-2015年，对云南西部、西北部、中部、东南部等多个滇重楼种植基地进行调查，了解滇重楼茎秆软腐病的发生情况和发病特点。

1.2.2 病原菌分离 采集刚发生软腐病的新鲜滇重楼茎秆，自来水冲洗去除表面泥土，75 %酒精擦拭表面，接种针挑取少量内部软腐组织于1.5 mL灭菌离心管中，加1 mL无菌水混匀获得病菌母液，用无菌水梯度稀释5次，每次稀释10倍，分别取每个浓度梯度的菌液50 μl，涂布于肉汁冻培养皿上，25 ℃培养，待长出单个菌落后，划线转接到新的培养皿中。

1.2.3 致病性测定 2015年5月滇重楼出苗期，取16株长势一致的7年生滇重楼，自来水冲洗去除表面泥土，在每株的茎秆和根状茎的结合处用解剖针刺10次，深度约3 mm，取其中8株浸泡在分离到的细菌菌液中，15 min后取出种植于花盆中、浇透水(每盆2株，栽培土为经121 ℃湿热灭菌30 min的红壤土)，另外8株作为对照用无菌水浸泡15 min，其他操作同细菌接种组。将栽好的全部植株置于荫棚中，观察发病情况。

1.2.4 病原菌鉴定 经致病性测定确认病原细菌后，扫描电镜观察菌体特征。

利用肉汁冻培养液(不加琼脂粉的肉汁冻培养基)，25 ℃、140 r/min摇床培养病原菌48 h，10 000 r/min离心10 min，取沉淀，根据Omega D3350细菌DNA小量提取试剂盒说明书进行DNA提取。用2 X PCR Master(Taq，染料)即用PCR扩增试剂盒，对病原菌的16S rDNA、gyrB和rpoB基因进行扩增。16S rDNA引物为27F、1492R，PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃补平7 min，4 ℃终止反应[6]。除退火温度不同外，gyrB、rpoB基因的PCR扩增程序同16S rDNA，gyrB基因引物为Up-1G-、UP-2G-，退火温度为60 ℃，rpoB基因引物为rpoBup、rpoBlow，退火温度为62 ℃[7]。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

测序结果在NCBI数据库进行BLAST比对，选择部分与待鉴定菌株序列同源性较高的序列，经过CLASTALX 1.83序列比对，利用MEGA6.06软件，采用NJ (邻接法 )法分别构建16S rDNA、gyrB基因和rpoB基因的系统发育树，系统树各分支的置信度用bootstrap test (自举检验法)检验，共进行1000次循环，根据Kimura-2参数计算各株遗传距离值，基于系统发育树对病原菌进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 滇重楼茎秆软腐病的特点及危害

滇重楼为草本宿根植物，一年出苗一次长出地上茎秆，发生茎秆软腐病的都为5年生以上能开花繁殖的植株，发病时间为植株出苗至叶展平时期，即每年的4-7月(不同区域的滇重楼由于气候差异导致出苗时间不同，即使同一地块中的不同植株出苗时间也会有较大差异)，当叶展平、茎秆停止长高后发病很少。发病起始位置为近地面茎秆基部与根状茎的结合处，首先在茎秆基部形成水浸状病斑，后软化，茎内部开始腐烂，产生刺激性臭味，发病部位沿着维管束向上蔓延造成整个茎秆稀软腐烂，叶片萎蔫、植株倒伏(图1)。

滇重楼出苗时茎秆肉质，含水量高、木质化程度低，部分植株出苗时由于生长过快、吸水过多会导致茎基部胀裂，利于病原菌的侵入，所以田间发生软腐病的多是茎秆较粗、生长旺盛的植株。该病通常不造成滇重楼地下根状茎的完全坏死，但植株发病会使地上部分腐烂死亡，存活的根状茎至少要1年后才能出苗，对植株生长造成较大影响。

经过调查，在云南西部的大理云龙县、西北部的丽江玉龙县、中部的昆明嵩明县、楚雄武定县以及东南部的红河元阳县、文山马关县等地的多个滇重楼种植基地，都有茎秆软腐病的发生，发病较重的地块发病率可达10 %，同一块地连续种植滇重楼的时间越长，发病越趋严重。目前滇重楼种子价格昂贵、供不应求，滇重楼植株一旦发生茎秆软腐病，地上部分完全坏死，造成当年种子绝收，后续几年种子产量下降，直接影响种植收益。

左：田间发病症状；右：室内人工接种致病症状Left: Plant naturally infected in field; Right: Plant infected by artificial inoculation图1 滇重楼茎秆软腐病症状Fig.1 Typical stem soft rot symptoms of Paris polyphylla Smith var. yunnanensis

2.2 病原菌形态特征与致病性测定

发生软腐病的滇重楼茎秆稀软腐烂，具刺激性臭味，显微镜下观察可见大量杆状、快速运动的细菌。经稀释分离获得一种编号为yunlong-xj的细菌，该菌在肉汁冻培养基上菌落圆形、光滑、乳白色、半透明，菌落边缘光滑或呈波状，菌落中央有略带乳黄色的瘤状突起，使整个菌落呈荷包蛋状(图2左)。扫描电镜下观察，菌体杆状，大小1.37～2.02(平均1.68±0.23)μm×0.46～0.54(平均0.49±0.03)μm(图2右)。

7年生滇重楼植株接种yunlong-xj后，第2天开始出现典型的软腐病症状(图1右)，从病组织中再次分离获得菌落形态与yunlong-xj一致的细菌。而无菌水接种的对照组植株能够正常生长，说明yunlong-xj为滇重楼软腐病的病原菌。

2.3 病原菌分子鉴定

2.3.1 基于16S rDNA的病原菌鉴定 16S rDNA编码原核生物核糖体小亚基 rRNA(16S rRNA)，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，几乎可以对所有的细菌进行属水平上的鉴定[8]，一般来讲，在种分类等级上，如果两个分类单位间的 16S rDNA 序列同源性大于97.5 %，可视为与模式菌株同种[9]。

菌株yunlong-xj经PCR扩增、测序获得748 bp16S rDNA片段，将其在NCBI数据库进行BLAST比对，比对出的同源序列均属胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)，同源性全部高达99 %以上，大部分同源菌株为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(P.carotovorumsubsp.carotovorum)。将菌株yunlong-xj与从GenBank中获取的同源性较高的部分序列构建系统发育树，结果如图3，菌株yunlong-xj属于P.carotovorumsubsp.carotovorum分支，与胡萝卜软腐果胶杆菌其他亚种以及Pectobacterium属的其他种明显区分，说明滇重楼软腐病病原细菌yunlong-xj最可能是P.carotovorumsubsp.carotovorum。

左：肉汁冻培养基上的菌落特征；右：扫描电镜下的菌体特征Left: Conlony characteristic of the pathogen in Nutrient Agar medium; Right: Morphological characteristics of the pathogenic bacteria under scanning electron microscope图2 滇重楼软腐病病原细菌形态特征Fig.2 Morphological characteristics of bacterium that causing stem soft rot of Paris polyphylla Smith var. yunnanensis

图3 基于16S rDNA序列构建的系统发育树Fig.3 Neigbor-joining dendrogram depicting the estimated phylogenetic relationships based on 16S rDNA sequences

2.3.2 基于gyrB基因的病原菌鉴定gyrB基因是编码细菌DNA解旋酶β亚单位的基因，进化速度比16S rRNA基因快，在区分和鉴定细菌近缘种方面，比非蛋白编码基因16S rRNA 具有更高的分辨率，适用于近缘菌株的区别和鉴定[10]。

经PCR扩增、测序获得yunlong-xj 1034 bp的gyrB基因片段，经BLAST比对，同源性大于90 %的菌株全部为Pectobacterium属，同源性最高的菌株序列编号为KJ818399(P.carotovorumsubsp.carotovorum)，同源性为99.8 %。基于gyrB基因序列，将菌株yunlong-xj与从GenBank中获取的同源性较高的部分序列构建系统发育树，结果如图4，菌株yunlong-xj属于P.carotovorumsubsp.carotovorum分支，能与P.carotovorum的其他亚种以及Pectobacterium属的其他种区分，说明滇重楼软腐病病原细菌yunlong-xj应为P.carotovorumsubsp.carotovorum，与基于16S rDNA的鉴定结果一致。

图4 基于细菌gyrB序列构建的系统发育树Fig.4 Neigbor-joining dendrogram depicting the estimated phylogenetic relationships based on gyrB gene sequences

图5 基于细菌rpoB序列构建的系统发育树Fig.5 Neigbor-joining dendrogram depicting the estimated phylogenetic relationships based on rpoB gene sequences

2.3.3 基于rpoB基因的病原菌鉴定rpoB基因是细菌RNA聚合酶β亚基的编码基因，存在于所有细菌中，比16S rRNA基因的区分能力更强，因此常被用来进行细菌的系统进化分析与分类鉴定研究[11]。

经PCR扩增、测序获得yunlong-xj 666 bp的rpoB基因片段序列，将其在NCBI数据库进行BLAST比对，同源性大于95 %的序列全部为Pectobacterium属，同源性最高的菌株序列编号为KJ818447(P.carotovorumsubsp.carotovorum)，与yunlong-xj仅有1 bp的差异。将菌株yunlong-xj与从GenBank中获取的同源性较高的rpoB基因序列构建系统发育树，结果如图5，菌株yunlong-xj属于胡萝卜软腐果胶杆菌P.carotovorumsubsp.carotovorum分支，能与P.carotovorum的其他亚种以及Pectobacterium属的其他种区分，该结果与基于16S rDNA、gyrB基因的鉴定结果一致。

根据病原菌的形态特征、16S rDNA、gyrB基因、rpoB基因序列，将滇重楼茎秆软腐病的病原菌鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种P.carotovorumsubsp.carotovorum。

3 讨 论

胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)原名胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种(Erwiniacarotovorumsubsp.carotovorum)[12]，是一种寄主广泛的植物病原细菌，能造成胡萝卜、土豆、大白菜、洋葱、魔芋、人参等[13]多种作物的软腐病，在世界范围内造成巨大经济损失[14-17]。该菌可以在植物表面附生或在土壤、水体里腐生，病原菌从植物的自然裂口、伤口等侵入后，通常潜伏在寄主植物的维管组织、薄壁组织及细胞间隙间，当环境条件适宜时大量繁殖，分泌果胶酶等胞外酶使寄主植物细胞壁和细胞间的连接分解，造成组织解体形成软腐[14,18]。

滇重楼的人工种植主要集中在云南，开展规模化栽培仅有10多年的时间，经调查，茎秆软腐病已经在云南主要的滇重楼种植区域出现，尚无有效的防治方法，其危害才初步显现。田间观察发现，部分生长过快的滇重楼植株茎秆基部常出现胀裂，植株容易倒伏，而发生茎秆软腐的滇重楼植株通常茎秆较粗、生长较快，通常从茎秆基部开始腐烂，说明人工种植条件下，水肥过足造成的滇重楼生长过快，是诱发滇重楼茎秆软腐病的重要原因，因此生产上要均衡施肥，适当控制氮肥的用量，培育壮苗。软腐病很难依靠使用化学药剂来防治，几乎只能依靠田间卫生管理和其他农业防治方法来实现[19]，生产实践中，应杜绝从软腐病发生严重的基地调运种苗，加强田间卫生管理，避免积水，发现病株应及时清除销毁，并用生石灰对苗穴进行消毒，冬天植株倒苗后应移除遮阳网，利用阳光进行田间消毒。一些滇重楼采种圃，开始的几年没有软腐病发生，经过多年连作后软腐病发生日趋严重，因此进行适当的轮作以及种源更新对预防滇重楼茎秆软腐病是必要的。由于P.carotovorumsubsp.carotovorum寄主广泛，除了携带病原的滇重楼作为传染源外，病原菌还可能来源于当地种植的其他作物，因此要避免选择发生过软腐病的地块种植滇重楼，栽种前要对种苗、土壤进行消毒。

4 结 论

本文首次报道滇重楼茎秆软腐病，该病已在云南主要的滇重楼产区出现，局部地块造成严重危害，其病原菌是胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(P.carotovorumsubsp.carotovorum)，该菌引起的大白菜、土豆等多种作物软腐病已在世界范围内发生且难以防治，滇重楼是一种驯化时间较短的药用植物，具有重要的药用和经济价值，随着种植面积的不断增加，各种病害问题日渐凸显，应加强相关研究。

致 谢：本研究在试验过程中得到云南省农业科学院药用植物研究所季鹏章博士的帮助，在此表示感谢！

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(责任编辑 王家银)

Pathogen Identification ofParispolyphyllaSmith var.yunnanensisStem Soft Rot

MA Wei-si1, YANG Bin1, YAN Shi-wu1, WANG Xin1, DONG Zhi-yuan1, LI Lin-yu1,ZHANG Xin-hua2, YANG Li-ying1*

(1.Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650205, China; 2.Dali Institute of Agricultural Sciences and Extension, Yunnan Dali 671005, China)

【Objective】The objective of this study is to identify the pathogen of stem soft rot ofParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz, and to know how the disease occurred as well. 【Method】The pathogen was isolated from tissues of soft rot stem ofP.polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz, tested and verified with Koch's postulates, and identified based on morphological and 16S rDNA,gyrB,rpoBgenes sequence. 【Result】the pathogen was identified asPectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum. 【Conclusion】P.carotovorumsubsp.carotovorumis the pathogen of stem soft rot ofP.polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.

ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz; Stem soft rot; Pathogen Iidentification;Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum

1001-4829(2017)7-1582-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.020

2015-08-05

云南省科技创新强省计划项目“高山药材优良种源繁育、选育及野生药材引种驯化集成创新研究与示范基地建设”(2014AE015)；云南省科技创新人才计划(2015HB102)；云南省科技惠民计划“湿热区林下药材生态复合种植及种子种苗繁育关键技术研究与示范”(2016RA057)

马维思(1986-)，回族，男，云南文山人，助理研究员，硕士，主要从事药用植物栽培与保护研究，E-mail：masilaoq@aliyun.com，Tel：0871-65033441，*为通讯作者：杨丽英，E-mail:daliyangly@163.com。

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