大鼠灌胃朱砂与复方牛黄消炎胶囊后汞的药代动力学研究

宋晓妮　陆宇婷　杨丹亿　汪生　杭太俊　宋敏

[摘要]復方牛黄消炎胶囊作为清热解毒、镇静消炎的经典复方，朱砂是其发挥药效的主要成分之一。该实验采用HNO3HClO4消解体系结合冷原子原子荧光光谱（CVAFS）分析技术检测大鼠全血中的汞元素。研究大鼠灌胃给药不同剂量朱砂和复方牛黄消炎胶囊后，全血中汞的药代动力学行为，探讨中药复方配伍对汞体内代谢过程的影响。研究发现大鼠灌胃高、中、低3个剂量朱砂和复方牛黄消炎胶囊后，全血中汞均呈非线性药代动力学特征。大鼠灌胃复方牛黄消炎胶囊后，与单味朱砂相比，全血中汞元素的tmax，Ke，CL/F显著降低，Cmax/dose，AUC/dose，t1/2显著增加，Vz/F，MRT不存在显著差异，提示经复方配伍后，汞元素在全血中吸收的总量显著增加且吸收速度加快，但消除速度减慢，提示长期服用可能会引起汞在体内的蓄积。

[关键词]朱砂； 复方牛黄消炎胶囊； 汞； 全血； 冷原子原子荧光光谱（CVAFS）

[Abstract]Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule was a classical compound prescription with the efficacy of heatclearing， detoxification， sedation and antiinflammation， with cinnabaris as one of its active ingredients The study focuses on the pharmacokinetics of mercury in rats after oral administration of cinnabaris and Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule， in order to explore the effect of combined traditional Chinese medicines on mercury metabolism In this study， the method of nitricperchloric acid digestion system coupled with cold atomicatomic fluorescence spectroscopy （CVAFS） was adopted to accurately determine mercury in whole blood of rats Fufang Niuhueng Xiaoyan capsule had three dose schemes of oral administration， namely equivalent clinical dose， 3 times of equivalent clinical dose and 10 times of equivalent clinical dose； And the doses of oral administration of cinnabaris was calculated according to that of Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule SPF grade healthy SD rats were fasted overnight before the oral administration with cinnabaris suspension （or Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule suspension） After oral administration of different doses of cinnabaris， no obvious changes in tmax and MRT were observed， while Cmax/dose， AUC048 h/dose and AUC0∞/dose decreased with the increase in dose， indicating that total mercury absorption in body was declining As the dose increased， Ke， CL/F decreased， and t1/2 increased， indicating that the elimination slowed down， and mercury metabolism showed nonlinear dynamic characteristics within a certain range of dose （22220 mg·kg-1） The total mercury metabolism in the whole blood of rats after oral administration with different doses of Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule also showed nonlinear dynamic characteristics The results were correlated with the low solubility of cinnabaris in the body Compared with cinnabaris， Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule showed no obvious changes in V/F and MRT， while Ke， CL/F， tmax decreased， and t1/2， Cmax/dose， AUC048 h/dose， AUC0∞/dose increased significantly The results showed that Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule accelerated absorption， slowed down elimination and improved the total absorption of mercury in the whole blood， indicating that Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule may contain components for promoting absorption and alleviating elimination of mercury Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule had an impact on the pharmacokinetics of cinnabaris， and longterm administration of cinnabaris （Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule） was possible to cause accumulation of mercury in the body This study could explain changes in efficacy of Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule， evaluate the rationality of compound medicines containing toxic elements and provide scientific basis for the rational and safe use of Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule

[Key words]cinnabaris； Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule； mercury； blood； cold atomfluorescence spectroscopy （CVAFS）

复方牛黄消炎胶囊（Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule）作為清热解毒、镇静消炎的中成药，历经数百年的流传应用，发展成为目前《中国药典》收载的由人工牛黄、黄芩、栀子、朱砂、珍珠母、郁金、雄黄、冰片、石膏、水牛角浓缩粉、盐酸小檗碱11味中药加工成的复方制剂[1]。作为含汞（朱砂）的中成药，其用药的安全性值得关注，因服用含朱砂中成药而发生的中毒事件时有发生[23]。由此可见，探讨中成药中复方配伍对汞代谢的影响是十分有必要的。

目前，对于中药中朱砂的的研究主要针对单味朱砂的慢性毒性研究[4]，但对朱砂中汞的药代动力学报道较少[5]，仅进行朱砂高剂量单次给药试验[6]，对中药复方配伍对汞体内代谢变化的影响未见报道。本研究利用HNO3HClO4消解体系结合冷原子原子荧光光谱（CVAFS）分析技术，对朱砂及复方牛黄消炎胶囊在大鼠体内的汞的药代动力学特征进行比较研究。

1材料与方法

11仪器AF610 D冷原子原子荧光光谱仪（北京瑞利分析仪器公司），AF2型汞元素荧光空心阴极灯，Explorer超纯水机（上海沉黄科学仪器有限公司），BS 21s型1/10万天平（德国赛多利斯公司），BS 110s型1/万天平（天津市泰斯特仪器有限公司），高级台式封闭电炉（天津市泰斯特仪器有限公司），所有玻璃仪器均用20%的硝酸浸泡24 h以上，并用超纯水洗净。

12药品与试剂复方牛黄消炎胶囊（牛黄消炎灵胶囊）（云南白药集团股份有限公司，批号WLKA1307）经冷原子原子荧光光谱法测定（n=3）汞含量为680%，水飞朱砂（凤凰县红飞药用朱砂有限责任公司，批号20160101）经冷原子原子荧光光谱法测定（n=3）汞质量分数为8524%，含量均以汞元素计。汞单元素溶液标准物质（GBW08617 中国计量科学研究院，批号15031），硝酸、高氯酸（国药集团化学仪器有限公司，优级纯），超纯水（1825 MΩcm，Explorer SERIES Water Purification System，上海沉黄科学仪器有限公司），重铬酸钾（上海凌峰化学试剂有限公司，分析纯），氢氧化钾（南京化学试剂有限公司，分析纯），硼氢化钾（纯度>95%，国药集团化学试剂有限公司）。

2方法

21复方牛黄消炎胶囊与水飞朱砂灌胃溶液取复方牛黄消炎胶囊内容物适量，研成细粉，混匀，以05% CMCNa分别制成质量浓度为15（临床等效剂量组），45，150 g·L-1的混悬液，给药前充分振摇使之分散均匀；取水飞朱砂适量，研成细粉，以05% CMCNa分别制成质量浓度为11，33，110 g·L-1的混悬液，给药前充分振摇使之分散均匀。

22储备液制备精密量取汞单元素溶液标准物质（1 g·L-1）05 mL至100 mL量瓶中，加5% HNO3005% K2Cr2O7水溶液稀释，定容后摇匀，得5 mg·L-1的储备液I；精密量取1 mL的储备液Ⅰ至50 mL量瓶中，加5% HNO3005% K2Cr2O7水溶液稀释，定容后摇匀，得100 μg·L-1的储备液Ⅱ，置4 ℃保存，临用前用5%HNO3005% K2Cr2O7水溶液稀释得到标准工作液。

23动物SPF级SD大鼠，8～12周龄，雌雄各半，体质量（200±20） g，上海杰思捷实验动物有限公司，实验动物生产许可证SCXK（沪）20130006。实验室温度控制在20～25 ℃，湿度在50%～60%。换气次数每小时20次以上，12 h照明。实验前禁食过夜（12 h），自由饮水（去离子水）。所有动物实验符合实验室动物饲料和使用指导原则，并通过中国药科大学伦理委员会的同意。

24氢化合物发生原子荧光的条件以2%的硝酸溶液为载流；01% KBH402% KOH的水溶液为还原剂；蠕动泵的转速为100 r·min-1；载气流量400 mL·min-1；辅助气流量400 mL·min-1；负高压-270 V；主灯电流30 mA；原子化器温度：冷原子（低温，200 ℃）。

25全血样品的处理取全血02 mL，置50 mL凯氏烧瓶中，加入HNO3HClO4（4∶1）5 mL，混匀，过夜。次日置电热板上，于120～140 ℃加热，保持微沸，必要时补加HNO3适量，加热至溶液澄清透明，溶液体积约1 mL，停止加热，取下放冷。用5% HNO3005% K2Cr2O7转移至10 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。同法制备空白溶液。

26动物实验72只SPF级SD大鼠，随机分为6组，禁食过夜后灌胃复方牛黄消炎胶囊混悬液（或朱砂混悬液），于给药后0，025，05，075，1，15，2，3，4，6，8，12，24，36，48 h于大鼠眼内眦静脉丛取血02 mL至含有肝素钠的离心管中，置-80 ℃保存待测。按人和动物间体表面积折算设计给药剂量，复方牛黄消炎胶囊混悬液的3个浓度水平对应3个不同的灌胃剂量，分别相当于成人的临床等效剂量（03 g·kg-1），3倍临床等效剂量（09 g·kg-1），10倍临床等效剂量（30 g·kg-1）。按照复方牛黄消炎胶囊处方中朱砂的含量（以生药计）进行折算，设计朱砂的给药剂量。

3结果

31标准曲线和定量限分别取500 μg·L-1的汞单元素溶液储备液10，20，40，80，160 μL至50 mL的凯氏烧瓶中，然后按照25项方法进行操作，得到质量浓度分别为5，10，25，50，100，200，400 μg·L-1的系列标准全血样品。以汞元素的峰面积（Y）对血药浓度（X，μg·L-1）进行直线回归。在上述质量浓度范围内全血中汞元素的线性响应良好，回归方程为Y=304X+73936（r=0999 6），定量下限为5 μg·L-1。

32回收率、精密度和准确度考察了血药浓度5，10，25，100 μg·L-1的加样回收率（n=6）。结果均在9720%～1091%，均值为（1046±41）%。CVAFS测定的批间跟批内精密度良好，RSD分别在40%～95%，32%～88%。准确度良好（表1）。

33稳定性考察了全血样品（5，10，25，100 μg·L-1）-80 ℃冰箱放置的稳定性，冻融稳定性以及消解结束后配制的样品溶液室温放置稳定性。结果表明全血样品在-80 ℃冰箱冰冻保存24 h，反复冻融3次，消解结束后样品溶液室温放置45 h的稳定性均良好，满足测定需要。

34药代动力学研究采用随行标准曲线外标法测定全血中汞元素的浓度，并设置低、中、高浓度的质控样品（含汞单元素质量浓度分别为5，25，100 μg·L-1）。采用WinNonlin 21处理血药浓度数据，达峰浓度和达峰时间采用实测值。运用IBM SPSS Statistics 19统计软件对tmax，t1/2，Ke，MRT进行MannWhitney

U检验，对lncmax/dose，lnAUC048 h/dose，lnAUC0∞/dose，lnVz/F，lnCL/F进行t检验。

35汞元素总量的分析大鼠灌胃高、中、低剂量朱砂和复方牛黄消炎胶囊后，其血药浓度时间曲线如图1～3。从图中可以看出在给药后的05～8 h全血中汞含量较高，随后降低并趋于平稳，主要药动学参数见表2。

4讨论

汞对巯基有高度的亲和力，血液中95%左右的巯基存在于红细胞，故汞可迅速结合红细胞，同时汞离子还与富含巯基的白蛋白结合[7]，所以汞在血浆跟血细胞中均有分布，而血细胞中汞的含量更高，因此选择全血作为研究汞在血液中动态变化规律的生物样品。

大鼠灌胃不同剂量朱砂或相当剂量复方牛黄消炎胶囊后，随着剂量的增加，全血中汞的Cmax/dose，AUC/dose，Ke均显著降低，t1/2显著增加，说明在此剂量范围内（22～220 mg·kg-1），全血中汞的代謝呈现非线性动力学特征，随着剂量的增加汞吸收的相对量变少，可能是因为朱砂为难溶性药物，在人体内的溶解度不会随着剂量的增加而增加。Ke显著降低，t1/2，CL/F显著增加，说明随着剂量的增加全血中汞的消除变慢。

复方牛黄消炎胶囊组与单味朱砂组相比，配伍后tmax显著提前，说明复方配伍加快了全血中朱砂的吸收速度。汞吸收加快，可能是因为复方中冰片的存在，冰片作为使药，具有促透作用[8]，同时黄芩的主成分黄芩素能够提高细胞膜的亲水性[9]，也可能提高药物的吸收速度。配伍后Cmax/dose，AUC/dose显著增加，说明复方配伍增加了汞元素在全血中的总量，原因可能是黄芩中的黄芩苷与汞结合，从而提高汞元素在体内的溶出[10]。配伍后Ke和CL/F显著降低，t1/2显著增加，说明复方配伍减慢了朱砂在体内的消除，增加了汞在体内蓄积的可能，长期服用可能会引起汞在体内的蓄积。总之，朱砂中的汞经复方牛黄消炎胶囊中多味中药配伍后，加快了吸收的速度和程度而减慢了消除，增加了汞在全血中的暴露总量，而对此现象产生的原因以及结合药效分析配伍的合理性将有待进一步探索。

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[责任编辑张燕]