外周血中树突状细胞及相关细胞因子水平与Graves病的关联分析*

北京大学深圳医院内分泌科 （广东 深圳 518036）

吴 嘉 徐秀双 谢 谦 徐晓燕 唐春梅

外周血中树突状细胞及相关细胞因子水平与Graves病的关联分析*

北京大学深圳医院内分泌科 （广东 深圳 518036）

吴 嘉 徐秀双 谢 谦 徐晓燕 唐春梅

目的 检测Graves病患者在治疗前后外周血中树突状细胞（DCs）不同亚群和相关细胞因子的数量和表达情况，并与健康对照组进行比较，分析DCs细胞亚群和相关细胞因子与Graves病的关联性。方法 利用流式细胞仪检测56例Graves病患者和30名健康体检者的外周血树突状细胞亚群数量，其中Graves病患者中30人为治疗前组、26人为治疗后组，同时利用ELISA检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）及白细胞介素-6（IL-6）等细胞因子的水平。结果 测定得出Graves病治疗前组浆细胞样树突状细胞（mDC）和髓样树突状细胞（pDC）值显著高于健康对照组，经治疗后mDC和pDC值明显降低，略高于健康对照组。通过对比3组细胞因子水平发现，Graves病治疗前组患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平均高于其他2组，治疗后组与健康对照组的细胞因子水平相近。结论 Graves病患者血中树突状细胞（DC）明显升高，细胞因子分泌失调，经治疗病情好转后，DC和细胞因子水平逐渐恢复正常，提示DC和细胞因子可能参与Graves病的发病机制，并有望作为分析Graves病治疗效果的一项依据。

Graves病；树突状细胞；细胞因子

Graves病(Graves'diseaes,GD)又称为毒性弥漫性甲状腺肿，是一种器官特异性的自身免疫性甲状腺疾病(AITD)[1]。树突状细胞(Dendritic cells，DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APC)，根据其表面标记，其可分为髓样树突状细胞(mDC)和浆细胞样树突细胞(pDC)[2]。它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，而成熟的DC能有效激活初始型T淋巴细胞向Th1、Th2细胞分化，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节[3]。本研究采用流式细胞仪技术检测Graves病患者在治疗前后外周血中mDC及pDC亚群的变化，同时用ELISA检测Th1、Th2相关的细胞因子，并与健康对照组进行比较，以探讨DC细胞亚群与Th1、Th2细胞失衡的关系，进一步研究DC细胞亚群和相关细胞因子与Graves病的关联性。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集我院内分泌科在2013年5月至2014年2月期间住院或门诊就诊的Graves病患者56例，均无其他自身免疫性疾病，且1年内未使用过免疫抑制剂。其中男性31例，占55.4%；女性25例，占44.6%；平均年龄43.5岁。并选取30例Graves病患者检测治疗前DC和细胞因子水平，作为治疗前组；另选取26例Graves患者在抗甲状腺功能亢进治疗后血甲状腺功能恢复正常，作为治疗后组；同期选取30例年龄和性别匹配的健康志愿者作为健康对照组，男女各15例,平均年龄为42.7岁。三组的平均年龄、性别均无统计学差异(P＞0.05)。

1.2 主要仪器和试剂流式细胞仪B D FACSArial，淋巴细胞分离液，荧光抗体，mDC标记试剂：(CD14 +，CD16 +)-FITC/CD85K-PE/CD123-PC5；pDC标记试剂：(CD14 +，CD16 +)-FITC/CD85K-PE/ CD33-PCS；鞘液、溶血素、HUMAN TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6 ELISA KIT等。

1.3 方法

1.3.1 外周血单个核细胞(PBMC)的分离：取研究对象的抗凝静脉血5mL，1000r/min转速离心10min，取上层血清再加入等体积的PBS液稀释1倍，随后加入淋巴细胞分离液，3000r/min密度梯度离心20min，吸取单核细胞层置于15mL离心管中，并用PBS液洗涤2次，最后得到PBMC，通过血球计数板计数。

1.3.2 DC比例检测：吸取200μL PBMC细胞悬浮液分别加入荧光抗体mDC标记试剂和pDC标记试剂；另取200μL PBMC细胞悬浮液加入FITC-mouse IgG和PE-mouse IgG混合均匀后置于室温避光30min；每管均要用2mL PBS洗涤3次，再加入1mL PBS重悬，通过流式细胞仪检测mDC和pDC占淋巴细胞的比例。

1.3.3 细胞因子检测：按照ELISA试剂盒说明书操作，分别检测3组研究对象血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6等细胞因子水平。并使用酶标仪检测492nm处吸光度，通过标准曲线法得到3组研究对象血清中细胞因子的浓度。

2 结 果

2.1 外周血中mDC和pDC水平比较分析3组研究对象的外周血DC亚群水平变化，结果显示Graves病患者在治疗前mDC和pDC在外周血DC中的比例较健康对照组均显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。而治疗后组DC亚群水平略高于健康对照组，较治疗前明显降低，如表1所示。

2.2 血清中4种细胞因子水平检测通过ELISA试剂盒检测Graves病治疗前后组和健康对照组患者血清中细胞因子的浓度，结果见表2。对比治疗前组和健康对照组，发现治疗前组患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6细胞因子均高于健康对照组，其中TNF-α在Graves患者中增多达266%(P＜0.05)，而IL-2水平在治疗前组显著降低，降幅达到331%(P＜0.05)。经治疗病情好转后，可见治疗后组的细胞因子水平逐渐恢复，与健康对照组接近。

3 讨 论

随着现代人生活节奏的加快，精神压力的增加，导致Graves病发病率逐年升高，已成为甲状腺功能亢进症中最为常见的一种。然而其具体发病机制仍未完全阐明。近年的研究认为，Graves病的发生发展是促甲状腺激素受体抗受体抗体(TSH receptor antibody，TRAb)对甲状腺刺激的结果，TRAb可持续而强烈地兴奋甲状腺细胞上的TSH受体，激化cAMP途径，使甲状腺细胞增生肥大，从而激活甲状腺细胞代谢，合成甲状腺激素功能增强。Graves病患者体内同时存在体液免疫及细胞免疫紊乱，属于器官特异性自身免疫病，因此调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞(Th)、调节性B细胞(Berg)以及树突状细胞等机体免疫细胞必然与Graves病的免疫病理形成密切相关。

表1 Graves病患者治疗前后组别与健康对照组DC亚群在外周血单核细胞的比例

表1 Graves病患者治疗前后组别与健康对照组DC亚群在外周血单核细胞的比例

注：a：P＜0.05，治疗前组与健康对照组比较；b：P＜0.05，治疗后组与治疗前组比较

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表2 Graves病患者治疗前后组别与健康对照组血清中细胞因子浓度的比较（pg/mL）

树突状细胞可直接向循环中的T细胞提呈抗原，调控机体免疫应答。根据细胞表型可分为mDC和pDC两个亚群，其中mDC是人体主要的抗原提呈细胞，可引起Th1免疫应答，促进细胞免疫的发生；pDC除了有较弱的抗原提呈功能外，在人体受到病毒攻击时能产生大量干扰素，抑制病毒复制并增强机体免疫功能，主要引起Th2免疫应答，在体液免疫应答过程中发挥重要作用[4]。为进一步探究DC细胞亚群与Graves病的关联性，本研究通过流式细胞仪检测患者在治疗前后外周血中mDC和pDC占淋巴细胞的比例，并与正常人的DC细胞亚群水平进行比较分析。此外，Th1和Th2细胞水平反映机体免疫应答状态，为研究Graves病的发病机制，可通过酶联免疫吸附试验检测血清中Th1和Th2细胞分泌的各细胞因子数量，从而分析Th1和Th2细胞水平，其中Th1细胞主要分泌IL-2和IFN-γ细胞因子[5]，而Th2细胞主要表达IL-4、IL-6、IL-10等细胞因子[6]。另有研究证实，IFN-α作为pDC分泌的细胞因子，与Graves病等自身免疫性甲状腺疾病的发生密切相关，因此一并作为本研究的监测指标[7-8]。

由研究结果可知，相比于健康对照组，Graves病治疗前组患者外周血中mDC和pDC水平显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明治疗前患者的细胞免疫和体液免疫明显紊乱。而经抗甲状腺亢进症治疗后患者血中mDC和pDC水平减少，与健康对照组相近，提示对症治疗后可改善机体免疫应答。且随着Graves患者外周血中pDC细胞占比增加，其分泌的IFN-α水平也明显上升，明显高于健康对照组(P＜0.05)。在治疗后组中，随着pDC水平的降低，IFN-α水平也逐渐恢复正常。此外，检测发现治疗前组INF-γ和IL-6水平均有所升高，而IL-2水平则显著降低(P＜0.05)。患者在经过治疗后，免疫功能逐渐恢复，血中INF-γ、IL-6和IL-2水平均有所改善，与健康对照组差异无统计学意义。

综上所述，Graves病作为一种器官特异性自身免疫病，与调控机体免疫应答的DC亚群和细胞因子水平密切相关，并且经过抗甲状腺亢进症治疗后，患者免疫应答功能逐渐恢复，DC亚群和细胞因子水平也将趋于正常。

[1] 中华医学会内分泌学分会.中国甲状腺疾病诊治指南[J]. 中华内科杂志,2007,46(10):876-882.

[2] 石军,万云,王敏等.人外周血CD123＋髓系树突状细胞的体外诱导及生物学特性研究[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(12):1091.

[3] Vasu C,Dogan RN,H olterman MJ,et al. Selective induction of dendriticcells using granulocyte macrophage-colony stimulating factor, but not fm s-liketyrosine kinase receptor 3-ligand, activates thyroglobulin-specific CD4+/CD25+ T cells and suppresses experimental autoimmune thyroiditis[J].J Immunol,2003,170(11):5511-5522.

[4] Liu YJ. Dendritic cells subsets and lineages and their functions in innate and adaptive immunity[J]. Cell,2001,106(3):259-262.

[5] Hayashi F,Watanabe M,Nanba T,et a1. Association of the-31C/ T functional polymorphism in the interleukin-1β gene with the intractability of Graves' disease and the proportion of T helper type 17 cells[J]. Clin Exp Immunol,2009,158(3):281-286.

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[8] Mandac J C,Chaudhry S,Sherm an KE,et a1. T he clinical and phys iological spectrum of inter feronalpha induced thyr oiditis:toward a new clas sification[J]. Hepatology,2006,43(4):661-672.

The Correlation of the Peripheral Blood Dendritic Cells and Cytokines in Graves' Disease Patients*

WU Jia, XU Xiu-shuang, XIE Qian,et al., Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China

ObjectiveTo explore the changes of different DC subsets and the secretion of cytokines level in the peripheral blood of Graves' disease patients compared to the healthy controls. Then the correlation of them were analyzed.MethodsFlow cytometry was applied to assess the frequency of different DC subsets in peripheral blood of 56 Graves disease patients and 30 healthy cases respectively. 56 Graves disease patients were divided into the before treatment group (30 cases) and the after treatment group (26 cases). Moreover, ELISA was performed to detect the secretion of TNF-α,IFN-γ, IL-2 and IL-6 in the peripheral blood.ResultsThe frequency of pDCs and mDCs in the before treatment group was higher than in healthy cases and it was significantly decreased after treatment. The secret of TNF-α,IFN-γ and IL-6 in Graves disease patients' peripheral blood were higher than that in other groups. Nevertheless, them were found similar levels of the after treatment group and healthy cases.ConclusionDendritic cells are increased significantly and the cytokines secretion disorder in the blood of Graves patients. However, they can be decreased by treatment, which indicates that DC subsets and the secretion of cytokines level may be involved in the pathogenesis of Graves. They are hopefully used as the basis for analysis of Graves disease treatment effect.

Graves' Disease; Dendritic Cells; Cytokine

R361+.3

A

深圳市科技计划项目（201203029）

10.3969/j.issn.1009-3257.2017.04.024

2017-07-11

吴 嘉，男，内分泌学专业，副主任医师， 主要研究方向：糖尿病、甲状腺疾病等

吴 嘉