肢体远程与局部缺血预处理对大鼠背阔肌肌皮瓣缺血再灌注损伤影响的比较

林威威，施小彤，谢永果，王维，陈锡华，张辉(广西医科大学附属口腔医院，南宁530000)



肢体远程与局部缺血预处理对大鼠背阔肌肌皮瓣缺血再灌注损伤影响的比较

林威威，施小彤，谢永果，王维，陈锡华，张辉
(广西医科大学附属口腔医院，南宁530000)

目的 比较局部缺血预处理和肢体远程缺血预处理对大鼠背阔肌肌皮瓣缺血再灌注损伤的影响。方法 将40只大鼠随机分为对照组、缺血组、局部缺血预处理组、肢体缺血预处理组各10只。对照组接受假手术，缺血组夹闭胸背动脉3 h后恢复血流灌注1 h，局部缺血预处理组夹闭肌皮瓣胸背动脉进行预处理，肢体缺血预处理组夹闭右股动脉进行预处理。采用缺血10 min后恢复血流灌注10 min进行预处理，预处理结束30 min后再重复缺血组操作。检测缺血前(T0)、缺血3 h(T1)、再灌注1 h(T2)后各组血清一氧化氮(NO)、内皮素(ET)水平，术后第5天光镜下观察背阔肌皮瓣的组织形态学变化。结果 与缺血组比较，局部缺血预处理组和肢体缺血预处理组在T1和T2时间点血清NO水平升高、ET水平降低(P均<0.05)，局部缺血预处理组和肢体缺血预处理组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。与缺血组比较，局部缺血预处理组和肢体缺血预处理组术后第5天肌皮瓣组织病理学损伤减轻，局部缺血预处理组和肢体缺血预处理组的病理学变化比较无明显差异。结论 局部缺血预处理和肢体远程缺血预处理均能减轻大鼠肌皮瓣的缺血再灌注损伤，对肌皮瓣具有保护作用。

缺血再灌注损伤；缺血预处理；移植皮瓣；背阔肌肌皮瓣；胸背动脉；股动脉；大鼠

缺血再灌注损伤(IRI)是指缺血的器官和组织恢复血流灌注后，缺血性损伤进一步加重的现象[1]。背阔肌肌皮瓣是外科手术最常选用的移植皮瓣[2]，如何采取安全有效的措施减少因缺血再灌注损伤导致的肌皮瓣缺血坏死，对于提高手术疗效、改善患者预后具有重要意义。局部缺血预处理是指某种器官受短暂的缺血刺激后产生的对随后较长时间缺血损害的耐受性。近年研究显示，局部缺血预处理和肢体远程缺血预处理均可减轻各器官和组织的缺血再灌注损伤[3～5]，但二者的效果比较尚未见报道。血管内皮细胞是血液和组织液之间的屏障，分泌多种活性物质来调节血管壁张力，在维持血管正常功能方面发挥重要作用[6]。一氧化氮(NO)和内皮素(ET)是由血管内皮细胞分泌的调节血管舒缩的重要因子，其血清水平能够反映血管内皮细胞的生理功能和受损程度[7]。2015年5月～2016年3月，我们通过建立大鼠背阔肌肌皮瓣缺血再灌注损伤模型，从保护血管内皮细胞的角度，比较局部缺血预处理和肢体远程缺血预处理对肌皮瓣缺血再灌注损伤的影响，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠40只，体质量250～300 g，由广西医科大学动物实验中心提供，适应性饲养1周，禁食12 h，自由饮水。ELISA检测试剂盒(上海心语生物科技有限公司)，酶标仪(BioTek Instruments，美国)，光学显微镜(Olympus，日本)。

1.2 动物分组与模型制备 采用随机数字表法将大鼠分为对照组、缺血组、局部缺血预处理组、肢体缺血预处理组各10只。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，取俯卧位，从大鼠右侧背部外侧肋弓下缘至腋窝做一纵形切口，切开皮肤，分离背阔肌，结扎肋间动脉穿支，保留胸背动脉为惟一的供血血管，将4-0丝线穿于胸背动脉下。稳定10 min后，局部缺血预处理组和肢体缺血预处理组分别用无损伤血管夹夹闭胸背动脉、右股动脉做缺血预处理，以背阔肌完全变为青紫为缺血成功的标志；缺血10 min松开血管夹，恢复灌流10 min，重复3个循环，稳定30 min后再进行缺血3 h操作。缺血组夹闭胸背动脉3 h后恢复血流。对照组在胸背动脉处仅穿线，不结扎。整个过程保持大鼠肛温在36～37 ℃。

1.3 血清NO、ET检测 于缺血前(T0)、缺血3 h(T1)、恢复灌流后1 h(T2)分别于左股静脉采集静脉血0.5 mL，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液，使用酶标仪采用ELISA法测定NO和ET水平。

1.4 大鼠背阔肌组织的病理形态学观察 术后第5天切取大鼠背阔肌中间部分组织，4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、包埋、切片，HE染色，光学显微镜下(400倍)观察背阔肌纤维、肌细胞和细胞核的病理形态学。

2 结果

2.1 各组血清NO、ET水平比较 各组T0时血清NO、ET水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与T0时比较，T1和T2时缺血组、局部缺血预处理组、肢体缺血预处理组NO水平降低，ET水平升高(P均<0.05)；与T1时比较，T2时缺血组、局部缺血预处理组、肢体缺血预处理组NO水平降低，ET水平升高(P均<0.05)；对照组各时间点比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与对照组比较，T1和T2时缺血组、局部缺血预处理组、肢体缺血预处理组NO水平降低，ET水平升高(P均<0.05)；与缺血组比较，局部缺血预处理组、肢体缺血预处理组NO水平升高，ET水平降低(P均<0.05)；局部缺血预处理组与肢体缺血预处理组各时间点NO、ET比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组不同时间点血清NO、ET水平比较

注：与同组T0时间点比较，aP<0.05；与同组T1时间点比较，bP<0.05；与对照组同一时间点比较，cP<0.05；与缺血组同一时间点比较，dP<0.05。

2.2 各组背阔肌病理组织切片观察 对照组肌纤维均匀，染色均一，细胞核形状正常，细胞结构完整；缺血组肌纤维肿胀明显，肌纤维断裂，部分细胞核消失，细胞部分结构破坏；局部缺血预处理组和肢体缺血预处理组肌纤维轻度肿胀，染色均一，肌肉纤维断裂较少，细胞核形状正常，轻度肿胀，细胞结构完整，两者的病理形态学变化无明显差异，均较缺血组明显减轻。

3 讨论

缺血再灌注损伤是指继缺血本身对组织造成损伤后，重新恢复的血液供应再次对组织内的细胞造成损伤，可引起组织细胞的坏死和凋亡。其发生机制还不是很清楚，目前认为内皮细胞屏障损伤、氧自由基损伤、NO生物利用率的减少、Ca2+超载、细胞炎症、细胞凋亡、微循环障碍、血管通透性和渗漏的增加均在其中起到了重要的作用[8]。

缺血预处理是一种通过多次间断短暂的重复缺血再灌注来减轻随后持续缺血损伤的方法，可以减轻器官和组织的缺血再灌注损伤，可分为局部缺血预处理和远程缺血预处理。局部缺血预处理是指某种器官受短暂的缺血刺激后产生的对随后较长时间缺血损害的耐受性。Mounsey等[9]建立猪的背阔肌模型，行缺血预处理后给予4 h的缺血，发现背阔肌存活面积明显提高，证实局部缺血预处理能够减少肌肉缺血坏死。Lintz等[10]通过检测血清中的细胞质酶和细胞膜的降解产物来检验局部缺血预处理对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用，发现局部缺血预处理能很好地避免缺血肌肉的糖元分解，保护肌肉免于损伤。远程缺血预处理是在局部缺血预处理基础上提出的，是指给予肢体或者其他远隔器官或组织短时间的非致死的缺血刺激，可以增加靶器官或组织对长时间缺血的耐受性，对靶器官和组织产生保护作用。近年来，有学者[11]提出肢体远程缺血预处理的概念。Kuntscher等[12]建立大鼠上腹部的脂肪皮瓣缺血再灌注模型，夹闭大鼠后肢股动脉行缺血预处理，发现预处理组肌皮瓣坏死面积减少，认为肢体缺血预处理能够对大鼠腹部任意皮瓣缺血再灌注损伤起到保护作用。Krag等[13]采用止血带对猪的后肢进行缺血预处理，然后对猪的背阔肌皮瓣进行4 h缺血和7 h再灌注，发现肢体远程缺血预处理可以减轻肌皮瓣的缺血再灌注损伤。本研究发现，与缺血组相比，局部缺血预处理组和肢体缺血预处理组肌纤维断裂、肌细胞肿胀程度及肌细胞核的病理形态学改变明显减轻。说明局部缺血预处理和肢体远程缺血预处理均可以减轻大鼠背阔肌肌皮瓣的缺血再灌注损伤。

NO是一种生物信使分子，广泛分布于生物体内，具有舒张血管平滑肌的作用。血管内皮细胞可以通过一氧化氮合成酶(NOS)将L-精氨酸转化为瓜氨酸来合成NO，合成的NO作用于血管壁中平滑肌细胞，激活鸟苷酸环化酶，增加环磷酸鸟苷(cGMP)生成，引起血管平滑肌细胞舒张，从而达到保护细胞和组织的目的[14]。ET是由21个氨基酸残基组成的活性多肽，是迄今所知最强的缩血管物质，可以激活钙通道增加Ca2+内流，促进血管平滑肌细胞收缩，继而引起血管收缩，血流量减少，细胞水肿，造成血管内皮细胞损伤[15]。NO和ET是维持血管内皮功能的重要生物活性分子。正常情况下，血管舒张因子NO释放和血管收缩因子ET释放处于相对平衡状态，以NO略占优势，以便于保持血流的流动；当组织遭遇长时间的缺血损害时，血管内皮功能发生障碍，引起内皮依赖的舒血管因子NO减少，内皮依赖的缩血管因子ET增多，NO/ET比例失衡，导致血管痉挛、异常收缩、加重组织坏死。因此，可以通过检测NO和ET的含量间接评价血管内皮功能。Jankauskas等[16]在抗氧化剂对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护作用的研究中，观察到缺血再灌注可引起大鼠肾脏血管收缩，血管阻力增加，肾血流量减少，内皮细胞破坏，减少了NO的生成，导致肾脏功能的衰竭，得出内皮细胞的功能障碍在组织的缺血再灌注损伤中起着重要作用。本研究结果显示，在缺血3 h和再灌注1 h，缺血组血清NO水平降低，ET水平升高；术后5 d观察病理组织学形态，发现大鼠的肌肉纤维肿胀明显，大部分肌肉纤维断裂及部分细胞核消失，说明缺血3 h再灌注1 h对血管内皮细胞功能造成了损伤，继而加重了大鼠背阔肌皮瓣缺血坏死。与缺血组相比，局部缺血预处理组和肢体缺血预处理组血清NO水平降低幅度及ET水平升高幅度均降低，两组间血清NO、ET比较无统计学差异。说明局部缺血预处理和肢体远程缺血预处理均可以减轻缺血再灌注对血管内皮细胞的损害，进而减轻大鼠背阔肌肌皮瓣的缺血再灌注损伤。

综上所述，局部缺血预处理和肢体远程缺血预处理均能减轻大鼠肌皮瓣的缺血再灌注损伤。局部缺血预处理是直接在血管蒂上进行缺血预处理操作，在临床中可能会损伤吻合的血管并延长手术时间，给临床操作带来不便；而肢体远程缺血预处理由于操作简便，无损伤性，且不延长手术时间，因此具有更好的临床应用价值。

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广西医疗卫生适宜技术研究与开发项目(S201411-02)。

施小彤(E-mail: hbb38@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.010

R622

A

1002-266X(2017)26-0035-03

2016-12-26)