西红花苷预处理对急性高海拔低氧下大鼠海马组织NF-κB及血清TNF-α的影响

张晓岩，张先钧，贾炜，蒲小燕，王海燕，梁宏，张杰(青海大学医学院，西宁810016)



西红花苷预处理对急性高海拔低氧下大鼠海马组织NF-κB及血清TNF-α的影响

张晓岩，张先钧，贾炜，蒲小燕，王海燕，梁宏，张杰
(青海大学医学院，西宁810016)

目的 观察西红花苷预处理对急性高海拔低氧条件下大鼠脑海马组织核转录因子-κB(NF-κB)表达及血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平的影响。方法 将96只大鼠随机分为对照组和观察组各48只，观察组给予西红花苷50 mg/(kg·d)肌内注射，对照组给予等量生理盐水肌内注射。连续给药3 d后运至高海拔低氧环境，在第1、3、5、7天取材。取大鼠脑海马组织，采用RT-PCR方法检测NF-κB mRNA表达，免疫组化法检测NF-κB表达；取大鼠颈动脉组，采用ELISA法检测血清TNF-α水平。结果 观察组海马组织NF-κB mRNA及蛋白表达在第1、3、5天明显低于对照组(P均<0.05)；观察组血清TNF-α水平在第1、3、5天明显低于对照组(P均<0.05)。结论 在急性高海拔低氧条件下,西红花苷提前干预能通过下调大鼠脑海马组织NF-κB表达及血清TNF-α水平，减轻炎性反应，发挥保护脑海马神经元的作用。

西红花苷；高海拔；低氧；脑海马组织；核转录因子-κB；肿瘤坏死因子α；大鼠

脑组织对缺血缺氧非常敏感，低氧条件可使脑海马神经元存活数量下降、凋亡增加[1]。高海拔地区低气压和低氧分压是一个独特的生态环境因素，严重影响机体正常的生理机能。急性低氧条件下，大脑急性缺氧可造成脑组织低氧损伤，引起不可逆的中枢神经系统损伤。藏红花为鸢尾科植物番红花的干燥柱头，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神、抗抑郁等功效。西红花苷是藏红花主要有效成分，是一类水溶性的类胡萝卜素，具有较强的抗氧化活性[2]。大量研究证实，西红花苷具有抗凋亡[3]、抗神经性炎症和神经细胞退行性变[4]、保护缺血性脑损伤、改善学习记忆障碍[5，6]等作用。西红花苷预处理可保护脑神经元在低氧条件下的损伤。2016年7月，我们采用西红花苷提前干预，观察急性高海拔低氧条件下大鼠脑海马组织核转录因子-κB(NF-κB)活性及血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的变化，为其防治急性低氧脑损伤奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级SPF级雄性SD大鼠96只，体质量180～200 g，由北京大学实验动物中心提供，适应性喂养1周。西红花苷购自Sigma公司；小鼠抗大鼠NF-κB p56一抗购自Abcam公司；山羊抗小鼠二抗及辣根过氧化物酶显色试剂盒购自武汉博士德公司；总RNA提取试剂盒、DNA MarkerⅠ、琼脂糖购自TIANGEN公司；TNF-α ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物分组及处理 将大鼠随机分为观察组和对照组各48只，在青海省西宁市(海拔2 200 m)分别给予西红花苷50 mg/(kg·d)、等量生理盐水后肢肌内注射。连续给药3 d后运至高海拔低氧环境(青海省果洛州甘德县，海拔4 200 m)饲养。两组于第1、3、5、7天各取12只大鼠，25%乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉，颈动脉取血，3 500 r/min离心10 min，取上清液，-20 ℃保存，用于检测血清TNF-α；然后将大鼠断头处死，快速取出全脑，冰上剥离海马组织，置于液氮中保存，用于检测NF-κB mRNA和蛋白。

1.3 海马组织NF-κB mRNA检测 采用RT-PCR方法。采用TRIzol法提取海马组织总RNA，逆转录合成cDNA。PCR扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成。NF-κB p56上游引物5′-TGCCTCCAGTGAGAAGAACA-3′,下游引物5′-GCACCAGAAGTCCAGGGTTA-3′,引物长度302 bp；β-actin上游引物5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′,下游引物5′-CAACACAGCCTGGATGGCTA-3′,引物长度480 bp。反应体系：模板2 μg，引物各1 μL，Mix 25 μL，用ddH2O补至50 μL。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，4 ℃ 1 h，共30个循环。取反应产物行琼脂糖凝胶电泳，BIO-RAD凝胶成像仪拍摄图片，Quantity one软件进行数据处理，以NF-κB p56与内参β-actin的比值计算其相对表达量。

1.4 海马组织NF-κB蛋白检测 采用免疫组化法。将大鼠海马组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，冠状面切片，常规烤片、脱蜡、水化及抗原修复。加入3% H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗3遍；5%胎牛血清封闭10 min，甩去余液；加一抗，37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3遍；加辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3遍。DAB显色，自来水冲洗干净后过蒸馏水；苏木素复染，自来水冲洗，脱水透明，树胶封片。在显微镜下找到海马CA1区，400倍下留取照片。以神经细胞核或胞质呈棕黄色为阳性细胞，每张取3个视野，用Leica QWinV3图像分析软件测IOD值。

1.5 血清TNF-α检测 采用ELISA法。将动脉血上清液按100 μL/孔加入相应孔中，室温孵育2 h。然后洗板5次，加入生物素化抗体工作液100 μL/孔，室温孵育1 h。洗板5次，后加入酶结合物工作液100 μL/孔，避光室温孵育20 min。后洗板5次，再滴加入显色剂100 μL/孔，避光室温孵育20 min。最后加入终止液50 μL/孔，混匀后即刻测量A450值。

2 结果

2.1 两组海马组织NF-κB mRNA表达比较 观察组第1、3、5、7天海马组织NF-κB mRNA的相对表达量分别为0.11±0.03、0.12±0.02、0.20±0.02、0.23±0.02，对照组分别为0.35±0.02、0.34±0.03、0.28±0.02、0.24±0.03，观察组第1、3、5天明显低于对照组(P均<0.05)。对照组第5、7天NF-κB mRNA相对表达量均低于第1、3天(P均<0.05)，观察组第5、7天NF-κB mRNA相对表达量高于第1、3天(P均<0.05)。

2.2 两组海马组织NF-κB蛋白表达比较 观察组第1、3、5、7天海马组织NF-κB蛋白的IOD值分别为758.04±38.83、774.98±37.81、1 642.01±272.57、1 893.57±254.06，对照组分别为3 507.46±317.96、3 432.57±446.68、2 688.62±246.95、2 053.08±226.13，观察组第1、3、5天NF-κB相对表达量均低于对照组(P均<0.05)。

2.3 两组血清TNF-α水平比较 见表1。观察组第1、3、5天血清TNF-α水平均低于对照组(P均<0.05)。对照组第5、7天血清TNF-α水平低于第1、3天(P均<0.05)。观察组第1、3、5天血清TNF-α水平呈逐渐上升趋势，但均低于对照组相应时间点(P均<0.05)。

表1 各组血清TNF-α水平比较

注：与对照组同期比较，*P<0.05；与同组其他时间比较，#P<0.05。

3 讨论

神经系统在高海拔低氧的特殊环境中形态结构及功能将会发生很大变化，而海马神经细胞极易受到低氧环境的损伤，其中多种促炎症因子发挥了极其重要的作用。西红花作为传统藏药材，主治“心忧郁积，气闷不散，瘀血”。近年来，其在高原环境对中枢神经系统的药理作用逐渐引起人们重视。西红花苷是藏红花最主要的活性成分，具有明显的抗氧化活性，能够抑制活性氧的产生，是一种神经细胞的强抗氧化剂[8，9]。我们的前期研究发现，西红花苷可以通过增加海马组织胰岛素样生长因子1表达，增强高海拔低氧条件下大鼠的学习记忆能力[7]。

NF-κB是与炎症及凋亡有关的重要转录因子，活化后促使机体效应细胞大量释放促炎细胞因子，导致组织发生过度炎症反应和组织损伤的关键环节[10]。NF-κB可以被多种刺激因素(如应激、炎症、氧自由基、低氧、紫外线等)激活，其主要作用是调控编码多种细胞因子参与免疫、炎症、细胞凋亡等生理和病理过程中的基因表达调控。当细胞处于静息状态时，NF-κB与NF-κB抑制蛋白(IκB)结合成p65蛋白/p50的异源二聚体或p65的同型二聚体，并以失活状态存在于细胞的胞质中。IκB和NF-κB以蛋白-蛋白相互作用，并掩盖NF-κB/Rel蛋白的核定位信号，使NF-κB无法向细胞核内移动。而当细胞受缺氧刺激时，IκB激酶(IKK)在氧化应激过程中被激活，可能通过IKKγ/NF-κB必需调节蛋白(NEMO)与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)途径交联而使ATM磷酸化，从而诱导NF-κB磷酸化，触发IκB多泛素化，并通过降解泛素-蛋白酶，导致NF-κB被活化，p65/p50与IκB解离而转入核内与特异的启动子结合，从而调控相关基因的表达[11,12]。NF-κB诱导众多细胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等高表达。研究[13]发现，脑缺血能激活NF-κB，继而促进多种炎症因子及凋亡基因的表达。本研究将大鼠用西红花苷预处理后运至高海拔低氧环境，观察大鼠脑海马CA1区NF-κB p56表达，发现观察组NF-κB p56蛋白和mRNA表达在第1、3、5天均低于对照组。这说明西红花苷预处理能够在第1、3、5天明显下调急性低氧条件下大鼠海马组织中NF-κB表达。

研究发现，TNF-α是较早释放的具有多种生物学效应的重要促炎细胞因子，在炎症反应过程中可激活细胞因子级联反应诱导白细胞介素和花生四烯酸代谢产物、氧自由基等合成，TNF-α在脑组织中被激活呈现高表达，具有神经毒性，可以加速神经细胞的死亡[14]。NF-κB能够增强TNF-α基因转录，在某些细胞和组织中，NF-κB与TNF-α具有密切关系[15]。NF-κB是机体对TNF-α产生生理性反应得到的重要中介物，NF-κB激活后可以诱导TNF-α表达。本研究结果显示，急性低氧条件可刺激TNF-α水平上升，而观察组血清TNF-α水平在第1、3、5天明显低于对照组。提示西红花苷预处理能够明显下调急性低氧条件下大鼠血清TNF-α的表达。第7天两组表达接近，可能是由于观察组失去药效导致。

综上所述，急性高海拔低氧条件可明显增加大鼠脑海马组织NF-κB表达，提高血清TNF-α水平，导致海马神经损伤；而西红花苷预处理可下调NF-κB活化与TNF-α表达，这可能是西红花苷减轻脑急性低氧损伤的机制之一。

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国家自然科学基金资助项目(81260685)；青海省科技厅项目(2016-ZJ-708)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.009

R282.5

A

1002-266X(2017)26-0032-03

2016-12-05)