广东三个柑橘品种不同生育期的黄龙病菌含量动态变化研究

程保平, 彭埃天, 宋晓兵, 凌金锋, 崔一平, 陈 霞

(广东省农业科学院植物保护研究所, 广东省植物保护新技术重点实验室, 广州 510640)



广东三个柑橘品种不同生育期的黄龙病菌含量动态变化研究

程保平, 彭埃天*, 宋晓兵, 凌金锋, 崔一平, 陈 霞

(广东省农业科学院植物保护研究所, 广东省植物保护新技术重点实验室, 广州 510640)

采用实时荧光定量PCR检测了广东省3个柑橘品种在不同生育期的黄龙病菌含量,探索其动态变化规律,为病害防控提供依据。结果表明,第一年,3个品种春梢期的黄龙病菌平均含量分别为3.52×105、4.76×105、1.03×105拷贝/g,显著低于相应夏梢期(5.50×105、9.48×105、2.50×105拷贝/g)和秋梢期(5.32×105、9.84×105、2.59×105拷贝/g);夏梢期与秋梢期含量又显著低于相应冬梢期(21.60×105、17.65×105、6.86×105拷贝/g)及果实成熟期(14.57×105、16.45×105、7.96×105拷贝/g);砂糖橘全年黄龙病菌含量与贡柑无显著差异,但均显著高于柠檬;第二年的数据与第一年类似,但砂糖橘和贡柑在多个生育期的含菌量比上年均显著升高,而柠檬所有生育期菌量均无显著变化。结果显示:柑橘病树内的黄龙病菌含量在春梢期最低,夏梢、秋梢期次之,冬梢期及果实成熟期最高;‘柠檬’相对耐病,体现为含菌量相对较低、增速较慢。

柑橘黄龙病; 病原菌含量; 动态变化规律; 不同柑橘品种

柑橘黄龙病是世界柑橘产业中危害最大的病害[1],在亚洲、非洲和美洲的近50个国家(地区)均有发生。其中,美国佛罗里达州80%以上柑橘树近年发现感染此病[2-3]。我国是柑橘主产国,柑橘产业在我国农村社会和经济中具有重要的地位和作用,但目前我国多数柑橘主产区都受到了该病的严重威胁。据调查,广东省有24万hm2橘园,年产值约300亿,目前有超过1/3的橘园感染柑橘黄龙病,年损失达上百亿元[4-7]。

柑橘黄龙病的病原为原核生物α-薄壁菌门变形菌纲的候选韧皮部杆菌属,有亚洲种、非洲种和美洲种3个种[8]。目前在我国传播的是亚洲种。该病菌主要由携菌的接穗、苗木和木虱传播[1, 9]。黄龙病菌可侵染柑橘属、金柑属、枳属、酒饼簕属、九里香属、黄皮属等属植物,寄主广泛,目前所有商业柑橘品种对黄龙病菌均不表现抗病,但不同的柑橘品种接种柑橘黄龙病菌后,出现症状的时间有所不同,目前原因尚不清楚[10-13]。

有研究认为,柑橘内的黄龙病菌菌量呈现出明显波动变化可能与寄主营养状况和外界温湿度变化等条件相关[14-16],但柑橘内的黄龙病菌菌量变化与春、夏、秋、冬梢期及果实成熟期之间的关系尚无人报道。

本研究利用实时荧光定量PCR对同一地理区域内的3个柑橘栽培品种在4个梢期和果实成熟期内的黄龙病菌含量进行了检测,探索病树内黄龙病菌在4个柑橘梢期和果实成熟期内的动态变化规律,为黄龙病的综合防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 Real-time PCR定量标准曲线的建立

插入黄龙病菌亚洲种16S rDNA的重组质粒来自于本研究室,使用TaKaRa公司的质粒提取试剂盒提取质粒,然后将重组质粒DNA原液按10倍梯度稀释,使每个反应管内的质粒拷贝数为109、108、107、106、105、104、103、102、101个,分别以每个稀释度的DNA为模板进行实时荧光定量PCR检测,3个重复。记录仪器的Ct值。根据标准曲线获得的线性回归方程为:Y=-0.286X+11.924。Y为反应管中柑橘黄龙病菌16S rDNA靶标拷贝数的对数值,X为仪器Ct值。根据线性回归方程计算每克病样组织内黄龙病菌量[17]=33.33×10-0.286X+11.924

1.2 荧光定量PCR 检测的引物与步骤

20 μL的反应体系中引物终浓度为250 nmol/L,探针终浓度为150 nmol/L[18],缓冲液参照TaKaRa探针法实时荧光定量PCR试剂盒说明书。PCR反应程序:95℃预变性20 s;然后95℃ 5 s,58℃ 40 s,40个循环。所有的PCR试验均以本研究室保存于防虫网室内的健康柑橘叶脉DNA为阴性对照,以保存于防虫网内的感染黄龙病的柑橘叶片为阳性对照,柑橘定期以喷粉法施用多菌灵、吡虫啉等农药防控病虫害。试验使用仪器为Roche,LightCycler®480Ⅱ型实时荧光定量PCR。

1.3 柑橘不同梢期及果实成熟期内含菌量变化测定

于第一年(2014年度)春梢期(2月14日、3月14日、4月15日),夏梢期(5月15日、6月16日、7月15日),秋梢期(8月15日、9月15日、10月15日),冬梢期(11月14日、12月15日)及果实成熟期(1月15日),在广东省广州市大丰柑橘基地内,在相似侵染环境中感染柑橘黄龙病的砂糖橘、贡柑和柠檬各8株3年生树的成熟梢上采集病样。每株树采样时先把树冠分为东南西北四个方位,每个方位分别随机采集两片老熟叶片,每株树采集8片叶片置于塑封袋,再保存于冰盒。制样时清洗并晾干柑橘叶片,然后剪取叶片中脉放入灭菌研钵,加入液氮研磨成粉状,从中取200 mg作为一个样品,按Axygen基因组提取试剂盒(爱思进公司)说明书提取样品的总基因组,最后进行实时荧光定量PCR检测。每次采样,每个栽培品种选择8株树,对每株树分别采集样品并检测1次,第二年(2015年度)重复以上试验,数据用SPSS statistics 19.0和T-test进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同梢期及果实成熟期内砂糖橘、贡柑、柠檬内含菌量Ct值变化

利用实时荧光定量PCR每月对病样内含菌量变化进行连续定量检测。结果表明,所有被检测样品均显阳性;黄龙病菌Ct值在不同梢期及果实成熟期内有明显的变化,第一年砂糖橘树体含菌量平均Ct值的趋势:春梢期>秋梢期>夏梢期>果实成熟期>冬梢期;贡柑:春梢期>夏梢期>秋梢期>果实成熟期>冬梢期;柠檬:春梢期>秋梢期>夏梢期>冬梢期>果实成熟期。表明砂糖橘、贡柑和柠檬春梢期含菌量Ct值均显著高于夏梢期和秋梢期;夏梢期和秋梢期的含菌量Ct值又显著高于冬梢期及果实成熟期(P<0.05);同一品种中,夏梢期与秋梢期的含菌量Ct值之间无显著差异,冬梢期与果实成熟期含菌量Ct值之间无显著差异(P>0.05)(图1,表1)。第二年,同一品种的不同梢期及果实成熟期之间病原菌Ct值的对比分析结果与第一年类似(图1,表1)。

图1 柑橘含菌量Ct值在两年内的动态变化Fig.1 Dynamic variation of pathogen Ct value in different diseased citrus plants in two years

栽培品种Cultivar第一年病菌含量Ct值 PathogenCtvalueinthefirstyear春梢期Springshootsperiod夏梢期Summershootsperiod秋梢期Autumnshootsperiod冬梢期Wintershootsperiod果实成熟期Fruitmaturationperiod砂糖橘Shatangju(28.07±1.25)aA(26.97±0.29)bB(27.06±0.44)bB(24.83±0.44)cC(25.57±0.64)cC贡柑Gonggan(27.45±1.00)aA(26.34±0.88)bB(26.27±0.8)bB(25.23±0.39)cC(25.33±0.39)cC柠檬Lemon(30.14±1.52)aA(28.59±1.15)bB(28.61±1.26)bB(26.83±0.90)cC(26.59±0.87)cC栽培品种Cultivar第二年病菌含量Ct值 PathogenCtvalueinthesecondyear春梢期Springshootsperiod夏梢期Summershootsperiod秋梢期Autumnshootsperiod冬梢期Wintershootsperiod果实成熟期Fruitmaturationperiod砂糖橘Shatangju(27.59±1.28)aA(25.92±1.19)bB(25.73±0.90)bB(23.85±0.95)cC(24.21±0.39)cC贡柑Gonggan(26.95±1.03)aA(25.63±1.28)bB(25.78±1.03)bB(24.24±1.37)cC(24.50±0.15)cC柠檬Lemon(29.29±1.25)aA(28.20±0.94)bAB(27.86±0.80)bBC(26.35±1.54)cC(26.58±0.56)cC

1) 同行数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著,不同大写字母表示在0.01水平差异显著。 Different lowercase letters and capital letters in the same row indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 levels, respectively.

2.2 不同梢期及果实成熟期内砂糖橘、贡柑、柠檬内含菌量变化

根据柑橘黄龙病菌16S rDNA基因的Real-time PCR标准曲线线性回归方程,把获得的黄龙病菌菌量Ct值按1.1小节的方法转化为每克植物组织内的含菌量。第一年的平均黄龙病菌含量,砂糖橘:春梢期<秋梢期<夏梢期<果实成熟期<冬梢期;贡柑:春梢期<夏梢期<秋梢期<果实成熟期<冬梢期;柠檬:春梢期<夏梢期<秋梢期<冬梢期<果实成熟期。统计分析显示:砂糖橘、贡柑和柠檬春梢期黄龙病菌含量均显著低于夏梢期和秋梢期;夏梢期与秋梢期的黄龙病菌含量又显著低于冬梢期及果实成熟期(P<0.05);但同一品种中,夏梢期与秋梢期的含菌量之间无显著差异,冬梢期与果实成熟期样品的含菌量之间也无显著差异(P>0.05)(表2)。

第一年全年砂糖橘每克组织黄龙病菌平均含量在3.52×105～21.60×105拷贝之间,与贡柑每克组织平均含量4.76×105～17.65×105拷贝之间无显著差异,但均显著高于柠檬每克组织平均含菌量1.03×105～7.96×105拷贝(图2,表2)。

第二年,每个品种不同梢期及果实成熟期之间及3个品种之间的含菌量对比分析结果与第一年的类似,但与第一年相比,3个品种中的黄龙病菌含量均有所升高,其中砂糖橘和贡柑春梢期的含菌量升高不明显,其余生育期均明显升高;柠檬不同梢期及果实成熟期的平均含菌量升高均不明显。

图2 砂糖橘、贡柑、柠檬样品内黄龙病菌含量在两年内的动态变化Fig.2 Dynamic variation of pathogen titers in different diseased citrus plants in two years

栽培品种Cultivar第一年病菌拷贝/105·g-1 Targetgenecopynumbersinthefirstyear春梢期Springshootsperiod夏梢期Summershootsperiod秋梢期Autumnshootsperiod冬梢期Wintershootsperiod果实成熟期Fruitmaturationperiod砂糖橘Shatangju(3.52±2.55)dA(5.50±1.02)cA(5.32±1.57)cA(21.60±5.62)aA(14.57±4.85)bA贡柑Gonggan(4.76±2.74)cA(9.48±4.71)bA(9.84±5.57)bA(17.65±5.16)aA(16.45±3.96)aA柠檬Lemon(1.03±0.95)cB(2.50±2.23)bB(2.59±2.42)bB(6.86±3.62)aB(7.96±4.21)aB栽培品种Cultivar第二年病菌拷贝/105·g-1 Targetgenecopynumbersinthesecondyear春梢期Springshootsperiod夏梢期Summershootsperiod秋梢期Autumnshootsperiod冬梢期Wintershootsperiod果实成熟期Fruitmaturationperiod砂糖橘Shatangju(4.70±2.98)cA(15.04±13.97)bA(14.59±9.22)bA(49.91±27.45)aA(34.38±9.90)aA贡柑Gonggan(7.03±5.71)cA(17.49±11.70)bA(14.69±10.20)bA(45.06±32.58)aA(27.61±2.70)aA柠檬Lemon(1.61±1.32)cB(2.84±1.57)bB(3.44±1.90)bB(12.71±11.72)aB(7.40±2.31)aB

1) 同行数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著,同列数据后不同大写字母表示在0.05水平差异显著。 Different lowercase letters in the same row and different capital letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

3 讨论

本研究对柑橘不同梢期及果实成熟期内的黄龙病菌含菌量动态检测显示:3个广东柑橘栽培品种春梢期的黄龙病菌含量显著低于夏梢期与秋梢期;夏梢期与秋梢期的含菌量又显著低于冬梢期及果实成熟期,这说明柑橘病样内的黄龙病菌含量变化与不同的柑橘生育期可能存在特定的关系。可能是因为春、夏、秋梢期内,气候适宜,柑橘营养吸收传导能力强,树势旺壮,树体强健,抑制延缓了黄龙病菌的危害;而冬梢及柑橘果实成熟的生育期内,气候适宜度降低,树体营养集中流向果实,加之冬季根系吸收能力减弱,导致病树营养失衡、树势转弱,从而难以抑制黄龙病的危害。检测结果显示,连续两年树体菌量波动趋势总体相似,但不同年度同个月份的菌量波动趋势并不完全一致,反映了不同栽培及气候条件对菌量的影响。因此,根据黄龙病菌在不同季节梢期的自然消长规律,做好梢期栽培管理、培养健壮发达根系、提高柑橘营养吸收传导、保证病树的营养平衡、提高柑橘树势、促进树体强健可能是延缓黄龙病危害的田间实用方法,值得探索。本试验结果可为黄龙病最佳防控时期的选择提供一定参考依据,对柑橘黄龙病的防控具有一定指导意义[19-21]。

有研究认为,目前所有的商业柑橘品种对黄龙病菌均不抗病,但不同品种柑橘感染黄龙病后出现病症的时间不同,症状严重程度也有所区别,其中柠檬接种黄龙病菌后病症较轻[10-13, 22-23]。本研究使用荧光定量PCR对黄龙病菌进行定量检测,探索了在相似侵染环境中感染柑橘黄龙病的3个柑橘品种贡柑、砂糖橘、柠檬的耐病性,结果表明:第一年砂糖橘的黄龙病菌全年平均含量与贡柑的全年平均含菌量无显著差异,但均显著高于柠檬的全年平均含菌量。第二年,3个品种之间的平均含菌量对比也有相似结果,但与第一年相比,3个品种的黄龙病菌含量均有所升高,其中砂糖橘和贡柑多个生育期的含菌量均显著升高;而柠檬的含菌量升高均不显著。这说明贡柑、砂糖橘、柠檬均不是抗黄龙病品种,但柠檬相对耐病,表现为植株内的黄龙病菌菌量相对较低,病菌增速相对较慢。

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Dynamic variation ofCandidatusLiberibacter asiaticus titer in three citrus cultivars at different growth periods in Guangdong Province

Cheng Baoping, Peng Aitian, Song Xiaobing, Ling Jinfeng, Cui Yiping, Chen Xia

(PlantProtectionResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,Guangzhou510640,China)

In order to provide references for synthetically preventing Huanglongbing disease, the dynamic variation of Huanglongbing pathogen was investigated in different growth periods of three citrus cultivars with real-time quantitative PCR detection method. The results showed that in the first year, average pathogen titers on the three citrus cultivars in spring shoots period were 3.52×105, 4.76×105, and 1.03×105copy/g, respectively, significantly lower than titers in summer shoots periods (5.50×105, 9.48×105, and 2.50×105copy/g) and autumn shoots period (5.32×105, 9.84×105and 2.59×105copy/g). Furthermore, the pathogen titers in summer shoots and autumn shoots periods were significantly lower than titers in winner shoots period (21.60×105, 17.65×105, 6.86×105copy/g) and fruit maturation period (14.57×105, 16.45×105and 7.96×105copy/g). Average pathogen titers in the Shatangju cultivars had no difference with titers in the Gonggan cultivars, but both were significantly higher than those in lemon. The data of the second year was similar to those of the first year, but the pathogen titers in the four growth periods of citrus Shatangju and Gonggan cultivars were significantly higher than those in the same period of the first year. The pathogen titers in all the 5 growth periods of lemon in the second year were samilar to that in the first year. The results showed that dynamic variation of Huanglongbing pathogen had a certain relationship to the different growth periods of citrus, lemon had higher disease tolerance, which mainly reflected in the lower titers and multiplication rate of the pathogen in the tree.

CandidatusLiberibacter asiaticus; bacteria titer; dynamic variation; different citrus cultivars

(责任编辑：杨明丽)

2016-10-09

2016-11-11

广东省重大科技计划专项(2014B020203003);广东省自然科学基金(2014A030310198);广东省现代农业产业技术体系建设专项(2016LM1077)

S 412

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.037

* 通信作者 E-mail: pengait@163.com