一株侵染柑橘木虱的球孢白僵菌的分离及鉴定

宋晓兵, 彭埃天, 程保平, 凌金锋, 陈 霞, 张炼辉

(1. 广东省农业科学院植物保护研究所, 广东省植物保护新技术重点实验室, 广州 510640; 2. 华南农业大学农学院, 广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室, 广州 510640)



一株侵染柑橘木虱的球孢白僵菌的分离及鉴定

宋晓兵1,2, 彭埃天1*, 程保平1, 凌金锋1, 陈 霞1, 张炼辉2

(1. 广东省农业科学院植物保护研究所, 广东省植物保护新技术重点实验室, 广州 510640; 2. 华南农业大学农学院, 广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室, 广州 510640)

从柑橘木虱虫体分离得到一株具有强致病性的虫生真菌GZMS-28,本文测定了该菌株对柑橘木虱的致病性,并分析了其rDNA ITS基因序列。试验结果表明,该菌株对柑橘木虱具有较强的致病性,浓度为1.0×108个/mL的分生孢子悬浮液处理柑橘木虱成虫7 d后,其校正死亡率达到95.7%。菌株GZMS-28的培养特征与白僵菌属球孢白僵菌较为一致,其rDNA ITS序列与GenBank中白僵菌属多个球孢白僵菌菌株的对应序列相似性达到99%以上,因此将菌株GZMS-28鉴定为球孢白僵菌Beauveriabassiana。

柑橘木虱; 球孢白僵菌; 致病性; 生物防治

柑橘黄龙病(Huanglongbing)能侵染各种柑橘类植物,是柑橘产业上的毁灭性病害,目前暂无有效的防治药剂,也没有抗病品种可供生产应用[1]。柑橘黄龙病病原(CandidatusLiberibacter spp.)是韧皮部限制的革兰氏阴性菌,至今尚未获得广泛认可的纯培养[2]。柑橘黄龙病的人为传播主要通过带病接穗嫁接和带病苗木调运,自然传播主要通过柑橘木虱Diaphorinacitri[3-4]。取食病树的柑橘木虱携带黄龙病菌后,再取食健康树完成病菌的传播[5],病原菌可以在柑橘木虱中肠上皮细胞增殖,后进入血腔继续增殖,再扩散到其他组织,最终到达唾腺[6-9]。

目前对于柑橘木虱多采用化学防治措施,化学农药的频繁使用造成了农药残留、环境污染以及昆虫抗药性等诸多问题,而生物防治被认为是最有效和最具应用前景的防治手段。据统计全世界已记载的虫生真菌大约有1 000种[10],而我国已发现的虫生真菌涵盖40多个属400多种[11]。虫生真菌是昆虫种群的主要控制因素,自然界中全部病死昆虫中约60%是由于感染真菌而导致死亡[12]。虫生真菌侵染昆虫的过程主要包括：识别寄主、机械破坏、分泌毒素、干扰代谢等,各种因素的共同作用导致寄主昆虫死亡[13]。本研究通过收集柑橘木虱虫体,进行病原真菌的分离,筛选出对柑橘木虱具有较强致病力的菌株,为利用虫生真菌防治柑橘木虱提供原始材料,对促进柑橘木虱生物防治技术的顺利开展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

分离虫生真菌所用的柑橘木虱采集于广东省广州市天河区九里香MurrayaexoticaL.上,测定病原菌致病性所用的柑橘木虱为本实验室温室中九里香植株上常年继代饲养的种群。

1.2 主要试剂和引物

2×EasyTaqPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司,基因组DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司,用于虫生真菌分离培养的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基,所用PCR引物为扩增真菌ITS区域的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 虫生真菌的分离纯化

田间采集柑橘木虱在超净工作台上进行分离操作,将木虱成虫浸于70%乙醇中消毒30 s,然后用0.1%升汞消毒1.5 min,再用灭菌水漂洗3次,用灭菌滤纸吸干木虱虫体上的水分,然后放置于PDA平板中。在27℃恒温培养箱中培养2～3 d,至虫体周围长出菌丝后,挑取菌丝转至新的PDA平板上,如此重复3次,然后用稀释纯化法对病菌进行单菌落分离。最终将分离纯化的菌株保存于PDA斜面培养基上,置于4℃冰箱保存。

1.4 菌株的致病性测定

将分离纯化的菌株接种到PDA平板上,于27℃恒温条件下培养10 d后,以灭菌水洗脱菌落上的分生孢子,制备成分生孢子悬浮液,用血球计数板确定孢子悬浮液的浓度,以灭菌水进行系列稀释,获得浓度分别为1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108个/mL的分生孢子悬浮液,并向其中加入终浓度为0.1%的吐温80。参照文献[14]的接种方法,取健康柑橘木虱成虫浸于不同浓度的分生孢子悬浮液中10～15 s,挑取处理后仍能活动自如的柑橘木虱放置于九里香幼嫩叶片上,然后置于27℃光照培养箱中(L∥D=14 h∥10 h,湿度95%以上)培养。上述各处理重复3次,每个重复为30头柑橘木虱,设含0.1%吐温80的灭菌水处理的柑橘木虱为空白对照。培养3 d后开始观察病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况,记录柑橘木虱的死亡数量,计算死亡率和校正死亡率,死亡率(%)=[(总虫数-存活虫数)/总虫数]×100,校正死亡率(%)=[(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)] ×100,最后利用DPS软件对所得数据进行回归分析。

1.5 菌株形态特征

将菌株接种到PDA平板中央,置于27℃恒温培养箱培养,定期观察菌落生长情况,并记录菌落颜色和形态,在光学显微镜下观察菌丝和孢子形态。

1.6 ITS序列鉴定

将菌株接种至PD培养液,于27℃恒温振荡培养5 d,以灭菌滤纸过滤菌液,取适量菌丝于灭菌研钵中,加入液氮研磨至粉末状,采用试剂盒法提取菌株总DNA。以提取的DNA为模板,利用通用引物ITS1和ITS4扩增菌株的rDNA ITS序列。PCR反应体系：DNA模板1 μL,2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,用ddH2O补足至总体积25 μL。反应条件为：95℃ 6 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 50 s,35个循环;72℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察并拍照。

1.7 测序及序列分析

于琼脂糖凝胶上割取PCR产物的目的条带,利用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化,然后交由Invitrogen公司利用引物ITS1/ITS4进行两端测序。利用DNAStar软件对所获得的目的基因序列进行比较分析,然后利用BLAST进行序列相似性比对,采用MEGA 5.05软件的邻接法构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株致病性测定

通过筛选获得1株对柑橘木虱具有强致病力的菌株,命名为GZMS-28。试验结果表明,接种的分生孢子悬浮液浓度越高,对柑橘木虱的致死效果越好,菌株GZMS-28对柑橘木虱的LT50和LT90也越短。浓度为1.0×104个/mL的分生孢子悬浮液对柑橘木虱的LT50为10.03 d,而浓度为1.0×108个/mL的分生孢子悬浮液的LT50仅为2.51 d;浓度为1.0×104个/mL的分生孢子悬浮液对柑橘木虱的LT90为33.37 d,而浓度为1.0×108个/mL的分生孢子悬浮液的LT90仅为5.28 d(表1)。

表1 球孢白僵菌不同孢子浓度对柑橘木虱的毒力测定结果

Table 1 Virulence test ofBeauveriabassianawith different spore concentrations againstDiaphorinacitri

孢子浓度/个·mL-1Concentration毒力回归方程ToxicityregressionequationLT50/dLT90/d相关系数(r)Correlationcoefficient1.0×104Y=2.54104+2.45534X10.0333.370.99651.0×105Y=2.92384+2.28726X8.0929.380.98701.0×106Y=3.17156+2.44340X5.6018.740.99921.0×107Y=3.38231+2.61613X4.1512.830.99811.0×108Y=3.40885+3.97393X2.515.280.9995

接种后孵育时间越长,柑橘木虱成虫的死亡率越高,菌株GZMS-28对柑橘木虱的LD50和LD90也越小。接种后3 d,菌株GZMS-28对柑橘木虱的LD50为3.43×107个/mL,接种后7 d仅为2.16×105个/mL,接种后10 d则仅为1.36×104个/mL;接种后3 d,菌株GZMS-28对柑橘木虱的LD90为5.63×1010个/mL,接种后7 d仅为2.14×108个/mL,接种后10 d则仅为3.05×107个/mL(表2)。

表2 不同孵育时间下球孢白僵菌对柑橘木虱的毒力测定结果

Table 2 Virulence test ofBeauveriabassianaat different incubation times againstDiaphorinacitri

孵育时间/dIncubationtime毒力回归方程ToxicityregressionequationLD50/个·mL-1LD90/个·mL-1相关系数(r)Correlationcoefficient3Y=1.99704+0.39855X3.43×1075.63×10100.97727Y=2.71655+0.42800X2.16×1052.14×1080.971510Y=3.41788+0.38261X1.36×1043.05×1070.9737

试验结果表明,经1.0×104个/mL的孢子悬浮液处理柑橘木虱成虫后3 d的校正死亡率为11.0%,处理后7 d的校正死亡率达31.8%;经1.0×108个/mL的孢子悬浮液处理柑橘木虱成虫后3 d的校正死亡率为62.0%,处理后7 d的校正死亡率达95.7%。试验处理后2 d,利用体视显微镜观察,在一些柑橘木虱虫体表观察到真菌的菌丝,处理后7 d,肉眼可见菌株GZMS-28的产孢结构,试验中还发现菌株GZMS-28对柑橘木虱若虫也具有侵染性(图1)。

图1 菌株GZMS-28对柑橘木虱若虫及成虫的侵染Fig.1 The strain GZMS-28 infecting citrus psyllid nymph and adult

2.2 菌株培养特性和形态特征

菌株GZMS-28在PDA培养基上于27℃恒温条件培养,其菌落为乳白色絮状,菌落蓬松、呈放射状生长,圆形或不规则形,菌丝生长较慢,但产孢速度较快,后期菌落背面呈淡黄色。菌株产孢细胞轮生或单生,分生孢子梗向顶部轴式产孢,形成弯曲的具有凸起的产孢轴。分生孢子透明,球形或卵形,壁薄,大小为2.5 μm×3.5 μm(图2)。

图2 菌株GZMS-28在光学显微镜下的形态特征(目镜×物镜=10×40倍)Fig.2 Morphological characteristics of the strain GZMS-28 under an optical microscope(400×)

2.3 菌株序列分析

经琼脂糖凝胶电泳检测,利用通用引物ITS1/ITS4扩增的PCR产物大小为570 bp左右。测序后用NCBI BLAST进行在线比对,菌株GZMS-28的rDNA ITS序列与GenBank数据库中多个球孢白僵菌菌株的对应序列(GenBank No. JX122736,JQ320365,GU565572,AY531972等)的相似性高达99%。在系统发育树中,菌株GZMS-28与Beauveriabassiana的多个分离物聚为1个分支,而宛氏拟青霉Paecilomycesvariotii的菌株(GenBank No. AY753335)则单独聚为另外1个分支(图3)。

图3 基于rDNA ITS序列构建的菌株GZMS-28和其他球孢白僵菌的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of GZMS-28 isolate and other Beauveria bassiana based on rDNA ITS sequences

根据菌株GZMS-28的培养特性、形态特征及rDNA ITS的序列分析,可将所分离的菌株鉴定为白僵菌属的球孢白僵菌。在分类地位上属于半知菌亚门Deuteromycotina,丝孢纲Hyphomycetes,丛梗孢目Moniliales,丛梗孢科Moniliaceae,白僵菌属Beauveria,球孢白僵菌Beauveriabassiana,GenBank登录号为KT715480。

3 小结与讨论

球孢白僵菌是一种重要的昆虫病原真菌,对环境和脊椎动物无害,其杀虫谱广,致病性强,是目前国内应用最广泛的昆虫病原真菌,但工业化、标准化及剂型加工等方面进展缓慢[15]。张艳璇等通过室内毒力试验发现球孢白僵菌对柑橘木虱具有强致死作用,1.0×104个/mL的孢子悬浮液作用第10天,柑橘木虱累计校正死亡率为92.68%[16]。利用胡瓜钝绥螨搭载白僵菌控制柑橘木虱,在两者共同作用下柑橘木虱卵和成虫3 d后的死亡率和患病率分别为98.4%和98.8%,对低龄若虫的感染率高达100%[17];Lezamagutiérrez等测定了球孢白僵菌对柑橘木虱的致病力,结果显示,球孢白僵菌对柑橘木虱成虫的致死率为42%,对柑橘木虱若虫的致死率为40%[18]。Pinto等测定了球孢白僵菌对柑橘木虱若虫的致死浓度及其与杀虫药剂的兼容性,结果表明,侵染10 d后的LC50为0.4×107个/mL,LC90为6.7×107个/mL,在温室条件下,杀虫药剂不影响球孢白僵菌在柑橘上的定殖[19]。

球孢白僵菌对昆虫寄主的侵染是机械压力和酶共同作用的结果[20],前人研究表明,在孢子萌发和侵入时需要多种酶类来降解昆虫表皮,包括蛋白质酶、几丁质酶、酯酶、脂酶以及淀粉酶,其中蛋白质酶和几丁质酶被认为是与侵染相关的主要酶类[21-23]。球孢白僵菌中的几丁质酶基因Bbchitl和Bbchit2已被克隆,高效表达几丁质酶基因Bbchitl能显著提高球孢白僵菌的毒力,重组菌株的致死中时LT50和致死中浓度LC50均显著低于野生型菌株[24],而且双价基因工程菌的毒力高于Bbchit l的工程菌株[25-27]。利用基因工程技术获得高效、稳定的工程菌株,将增强球孢白僵菌对柑橘木虱的毒力、对环境的适应性、延长孢子储藏期,对促进球孢白僵菌杀虫剂商品化生产和应用具有重要意义。

在真菌分类体系中白僵菌一直属于半知菌亚门,丝孢纲,丛梗孢目,丛梗孢科,白僵菌属[28],本文仍沿用了传统的白僵菌分类体系。随着对白僵菌分子进化和系统发育的研究,将白僵菌归类于双核亚界,子囊菌门,盘菌亚门,粪壳菌纲,肉座菌亚纲,肉座菌目,虫草菌科,虫草属[29]。Rehner等对不同国家和地区的86株白僵菌进行了ITS和延长因子的分析,将白僵菌分为6个进化支,分别为A：球孢白僵菌,包括有性和无性型球孢白僵菌;B：布氏白僵菌;C：无性型且源自欧洲和北美洲的球孢白僵菌;D：苏格兰白僵菌和蠕孢白僵菌;E：无性型和有性型且源自亚洲的白僵菌;F：多形白僵菌[30]。

本文测定了球孢白僵菌菌株GZMS-28对柑橘木虱的致病性,该菌株产孢速度快,致死率高,具有较好的生防潜力。菌株的产孢条件、孢子萌发率、生长速率等生物学特性需要进一步研究,尤其是菌株的田间应用效果有待试验,未来可将其开发成优良的生防菌制剂,促进柑橘木虱虫生真菌杀虫剂的产业化进程。

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(责任编辑：杨明丽)

Isolation and identification of aBeauveriabassianastrain infectingDiaphorinacitri

Song Xiaobing1,2, Peng Aitian1, Cheng Baoping1, Ling Jinfeng1, Chen Xia1, Zhang Lianhui2

(1.ResearchInstituteofPlantProtection,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,Guangzhou510640,China; 2.AgriculturalCollegeofSouthChinaAgriculturalUniversity,GuangdongProvinceKeyLaboratoryofMicrobialSignalsandDiseaseControl,Guangzhou510640,China)

The strain GZMS-28 with strong pathogenicity was isolated fromDiaphorinacitriand its pathogenicity againstD.citriwas examined. Its rDNA ITS gene sequence was also analyzed.D.citriadults were treated by conidial suspension at the concentration of 1.0×108spores/mL, and the corrected mortality rate was 95.7% after 7 days. The results showed that the strain has a strong pathogenicity againstD.citri. The study found that the morphological characteristics of the strain were consistent with that ofBeauveriabassiana. The sequence alignment result showed that the strain GZMS-28 shared 99% homology with the sequences retrieved from GenBank (acc. nos. JX122736, JQ320365, GU565572 and AY531972). According to the morphological characteristics and rDNA ITS sequence analysis, the strain GZMS-28 was identified asB.bassiana.

Diaphorinacitri;Beauveriabassiana; pathogenicity; biocontrol

2016-04-11

2016-07-16

广东省农业领域引导项目(2013B020309004)；广东省科技计划项目(广东省农作物病虫害绿色防控技术研究开发中心建设)；广东省公益研究与能力建设项目(2014B020203003)；广东省现代农业产业技术体系建设专项(2016LM1077)

S 436.661, S 476.12

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.026

* 通信作者 E-mail：pengait@163.com