湖南省番茄和牵牛花上双生病毒的分子鉴定

2017-08-09班一云周雪平

植物保护 2017年4期

关键词：双生黄化牵牛花

班一云, 丁波, 周雪平

(中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)

湖南省番茄和牵牛花上双生病毒的分子鉴定

班一云, 丁波*, 周雪平*

(中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)

双生病毒是一类在全世界范围内广泛发生的单链环状DNA病毒。本文对从湖南采集到的6例(洋姜、番茄、萝卜、赛葵、甘薯、牵牛花)疑似双生病毒侵染的植物叶片进行了分子鉴定。利用滚环扩增技术(RCA)对样品DNA进行扩增,分别对其RCA产物进行酶切,并将酶切得到的片段测序后进行BLAST比对,结果显示番茄样品中的病毒分离物与番茄黄化曲叶病毒相似性最高(99%),牵牛花样品中的病毒分离物与甘薯卷叶病毒相似性最高(99%),证明这两个分离物是单组分DNA-A双生病毒。这是在湖南省首次发现并报道双生病毒的全核酸序列。

番茄黄化曲叶病毒; 甘薯卷叶病毒; DNA-A

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链DNA病毒,一般发生在热带和亚热带地区,寄主范围十分广泛,在全球范围内造成重大损失[1]。番茄黄化曲叶病毒Tomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV)和甘薯卷叶病毒Sweetpotatoleafcurlvirus(SPLCV)均属于双生病毒科Geminiviridae的菜豆金色花叶病毒属Begomovirus,该属病毒主要以烟粉虱传播,危害极为严重[2-4]。番茄黄化曲叶病毒是侵染番茄LycopersiconesculentumMill的主要病毒之一,最早在以色列被发现,1964年正式被命名[5]。该病毒引起植株曲叶、黄化、矮化等症状,常对番茄栽培地区造成毁灭性危害[6]。我国是世界上最大的甘薯IpomoeabatatasLan生产国,而甘薯卷叶病毒主要侵染旋花科植物,其危害严重阻碍了甘薯产业的发展[7-8]。牵牛花Pharbitisnil是一种观赏植物,并且具有药用价值,其生长适应性强,田间路边随处可见。研究表明,双生病毒可经烟粉虱在牵牛花与作物之间相互传播[9-10],因此牵牛花对双生病毒重组、传播及扩散都有重要的作用,对作物生产构成了严重的威胁[11]。目前,受全球气候变暖、国际贸易加强及人类活动等影响,双生病毒病害在我国的危害范围不断扩大[12]。因此,对不同地区、不同寄主的双生病毒进行鉴定,进一步明确该病害在我国的发生、分布及危害情况可为病毒病防控打下基础。本研究对从湖南省采集的样品进行了分子鉴定,发现番茄样品被TYLCV侵染,而牵牛花样品被SPLCV侵染,TYLCV和SPLCV分离物的全基因组大小均约2.8 kb的单链环状DNA分子。病毒基因组共编码6个开放阅读框(open reading frame,ORF),分别为AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4[13-15],并未检测到DNA-B和DNAβ组分。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

2016年10月在湖南省长沙市采集到疑似被双生病毒侵染的植物叶片样品6份,分别为洋姜、番茄(图1a)、萝卜、赛葵、甘薯和牵牛花(图1b)。阳性对照为本实验室保存的番茄黄化曲叶病毒和甘薯卷叶病毒。

图1 从湖南省采集的番茄和牵牛花样品的感病症状Fig.1 Symptoms of tomato and morning glory samples collected from Hunan Province

1.1.2 试剂及仪器

FastDigest内切酶,购自Thermo Scientific公司;pLB零背景快速克隆试剂盒,购自天根生化科技公司;2×EasyTaqPCR Super Mix,购自全式金生物技术公司;KOD-Plus-Neo高保真酶试剂盒,购自Toyobo公司;E.Z.N.A.Gel Extraction Kit,购自Omega Bio-Tek公司;TempliPhi Amplification Kit,购自GE公司;Centrifuge 5424离心机,购自Eppendorf公司;Gel Doc XR+凝胶成像系统,T100 Thermal Cycler PCR仪,购自Bio-Rad公司;Tissuelyser-48全自动快速样品研磨仪,购自上海净信科技公司。

1.2 方法

1.2.1 叶片总DNA提取

采用CTAB法提取样品叶片总DNA。分别取0.1 g叶片组织放入预先加入一枚钢珠的2 mL离心管中,液氮速冻后利用全自动快速样品研磨仪将样品研磨至粉状,加入500 μL 65℃水浴预热的2% CTAB抽提缓冲液,65℃水浴保温1 h后加入等体积的24∶1的氯仿/异戊醇振荡混匀,12 000 r/min离心10 min,转移上清至新的1.5 mL离心管中。然后加入1/10体积醋酸钠(pH=5.2)和2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇,混匀后于-20℃放置1 h,12 000 r/min离心10 min以沉淀DNA,弃上清后用1 mL 75%乙醇将沉淀清洗1次,12 000 r/min离心10 min弃上清后干燥,最后加入适量去离子水溶解DNA,置于-20℃保存。

1.2.2 病毒基因组的滚环扩增及酶切鉴定

利用TempliPhi Amplification Kit对样品总DNA进行滚环扩增。将1 μL DNA(约10～20 ng)加入到5 μL样品缓冲液中,95℃变性3 min后立即置于冰上10 min,然后加入5 μL反应缓冲液和0.2 μL DNA聚合酶,混匀后置于30℃反应18～20 h,最后65℃加热10 min以终止反应。选取多种双生病毒含有的酶切位点,采用相应的限制性内切酶分别对6个样品的RCA产物进行酶切以获得特异性片段。

1.2.3 病毒基因组的克隆测序及全长序列获取

将酶切得到的片段连接至pLB载体,由北京擎科生物公司进行测序,在NCBI网站对测序结果进行BLAST比对,结果表明番茄样品分离物与TYLCV的相似性最高,牵牛花样品分离物与SPLCV的相似性最高。根据测得的部分序列设计特异引物对：NdeI-F(5′-AAGTATGAGAATCATACTGAAAA-CGCC-3′)/NdeI-R(5′-GGCTGCCTCCTGATGATTATAAGTT-3′)和NcoI-F(5′-CAGATCGAATCA-CTTTCACCCCA-3′)/NcoI-R(5′-TTCGGTGAGACCAGATCGAAGA-3′)分别扩增番茄样品和牵牛花样品分离物的DNA-A全长。同时分别利用DNA-B组分的通用引物CR01/CR02[2]和DNA-β的通用引物beta01/beta02[16]对样品进行PCR扩增,以期获得DNA-B和DNA-β序列。

1.2.4 病毒基因组序列比对及进化树构建

利用DNAMAN 5.2.2软件对筛选的阳性克隆序列进行比对,最终确定病毒分离物的基因组全序列。在NCBI数据库中进行BLAST相似性比对分析,并从中选取已报道的TYLCV和SPLCV的代表性同源序列,在MEGA 6.0[17]中采用邻接法(Neighbor-joining)构建全基因组序列进化树,系统进化树中bootstrap参数值设置为1 000。

2 结果与分析

2.1 RCA产物酶切检测

以提取的植物基因组总DNA为模板分别进行RCA扩增,通过酶切样品的RCA产物,从番茄和牵牛花样品中均得到了2.5～3.0 kb左右的条带(图2),割胶纯化后克隆测序,序列BLAST比对结果显示，番茄样品的分离物与GenBank中番茄黄化曲叶病毒(KX034547)的相似性最高(99%),命名为TYLCV-HN(KY783940);牵牛花样品中的分离物与甘薯卷叶病毒(FJ176701)的相似性最高(99%),命名为SPLCV-HN(KY783941)。利用通用引物CR01/CR02[2]和beta01/beta02[16]对样品进行PCR扩增,结果均未检测到DNA-B或DNA-β组分,推测TYLCV-HN和SPLCV-HN均为仅含有DNA-A组分的单组分双生病毒。

图2 湖南省采集样品的RCA产物的酶切鉴定Fig.2 Enzyme digestion on the RCA products of samples from Hunan Province

2.2 病毒基因组的序列测定和分析

通过酶切RCA产物得到番茄和牵牛花样品分离物的基因组片段,分别设计特异引物扩增DNA-A全长(图3),每个分离物均检测3个阳性克隆,测序结果表明各分离物病毒基因组序列之间无任何差异。其中,TYLCV-HN全长为2 781 bp,为单链闭合环状DNA,共编码6个ORF,其中病毒链编码2个ORF：AV1(308-1084)和AV2(148-498),互补链编码4个ORF：AC1(1542-2615)、AC2(1226-1633)、AC3(1081-1485)和AC4(2171-2464)。SPLCV-HN全长为2 827 bp,为单链闭合环状DNA,共编码6个ORF,其中病毒链编码2个ORF：AV1(301-1065)和AV2(132-476),互补链编码4个ORF：AC1(1587-2681)、AC2(1232-1678)、AC3(1081-1515)和AC4(2267-2524)。

图3 利用特异引物扩增番茄样品和牵牛花样品中双生病毒分离物基因组全长Fig.3 PCR amplification of the full genome of the geminiviruses on tomato and morning glory with specific primers

2.3 TYLCV-HN及SPLCV-HN的序列分析

从NCBI中选取有代表性的同源序列和TYLCV-HN和SPLCV-HN序列进行序列比对,采用邻接法(neighbor-joining)分别对TYLCV和SPLCV构建进化树(图4)。从进化树图中可以看出,TYLCV-HN与云南分离物的亲缘关系最近(图4a),SPLCV-HN与江苏、安徽等地分离物的亲缘关系最近(图4b)。

3 讨论

本研究通过对从湖南省采集的6例样品进行检测及鉴定,证明双生病毒的危害进一步扩大到了湖南省,为进一步研究我国双生病毒的分布情况及分子变异情况提供了一定的科学依据。根据双生病毒科病毒的命名规则,全基因组核酸序列的相似性大于89%被命名为同种病毒的不同株系,小于89%则被命名为不同种的病毒[18],因此将TYLCV-HN确定为TYLCV的一个分离物,SPLCV-HN为SPLCV的一个分离物。这是首次在湖南省发现并报道双生病毒。

图4 TYLCV和SPLCV不同分离物的核苷酸序列进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of different isolates of TYLCV and SPLCV

番茄在湖南省的生产生活中占有重要地位,它不仅是人们日常食用的主要蔬菜,番茄产业也为当地的农民增加了收入。然而,番茄黄化曲叶病毒病是一种发生于番茄上的毁灭性病害[19],它严重制约了番茄产业的发展。目前,该病害在我国传播呈现出由南向北的发展趋势,并且逐年加重[20]。从进化树关系图中可以看出,TYLCV-HN和云南等省市的分离物的序列亲缘关系最近,并且其保守性也很高,所以我们推测从湖南省检测到的双生病毒很可能是从周边省份传入。湖北省与湖南省相邻,并且在2015年已有双生病毒发生的报道[21],但是两地分离物的亲缘关系却不是最近(图4a),可见分离物亲缘关系的远近并不与地域呈正相关。

由于TYLCV可随种苗等传播,所以有必要在调种前进行检测,同时也建议加强田间管理工作,及时清除病苗和适时施肥等[22];而积极培育选择抗病品种也会在很大程度上减少经济损失。

甘薯卷叶病毒主要侵染旋花科植物,在中国从南到北均有发生,不但危害了甘薯产业的发展,还严重影响了牵牛花的经济价值[7-8]。作为一种主要的观赏植物,牵牛花在田间路边随处可见。研究表明,双生病毒可经烟粉虱在牵牛花与作物之间互传,作为双生病毒的中间寄主,牵牛花对其重组、传播及扩散都有重要的作用[9]。因此,在平时作物生产过程中应加强检疫,使用无毒种苗,发现病株后及时拔除。

RCA是一种新近发展起来的恒温核酸扩增方法,可以直接从样品总DNA扩增目的DNA,实现对靶病毒的信号放大,在生物大分子检测方面有重要的应用价值,同时也提高了双生病毒的检出率[23-24]。本研究通过酶切样品的RCA产物快速准确地检测到番茄和牵牛花样品中的双生病毒序列,进一步明确了该病害在我国的发生及分布情况,为双生病毒病害的防控提供了参考。

[1] Hanley-Bowdoin L, Bejarano E R, Robertson D, et al. Geminiviruses: masters at redirecting and reprogramming plant processes [J]. Nature Reviews Microbiology, 2013, 11(11): 777-788.

[2] Fondong V N, Pita J S, Rey M E, et al. Evidence of synergism betweenAfricancassavamosaicvirusand a new double-recombinant geminivirus infecting cassava in Cameroon [J]. The Journal of General Virology, 2000, 81(1): 287-297.

[3] Shafiq M, Asad S, Zafar Y, et al.PepperleafcurlLahorevirusrequires the DNA B component ofTomatoleafcurlNewDelhivirusto cause leaf curl symptoms [J]. Virology Journal, 2010, 7(1): 367-374.

[4] Mansoor S, Briddon R W, Zafar Y, et al. Geminivirus disease complexes: an emerging threat [J]. Trends in Plant Science, 2003, 8(3): 128-134.

[5] Cohen S, Harpaz I. Periodic, rather than continual acquisition of a new tomato virus by its vector, the tobacco whitefly (BemisiatabaciGennadius) [J]. Entomologia Experimentalis et Applicata, 1964, 7(2): 155-166.

[6] 宋建军, 刘红宵, 仇燕, 等. 番茄黄化曲叶病毒病的发生分布及防治对策[J]. 北方园艺, 2010(7): 147-150.

[7] 乔贞贞, 秦艳红, 乔奇, 等. 甘薯卷叶病毒江苏分离物基因组全长序列测定及其外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达[J]. 河南农业科学, 2012, 41(4): 86-89.

[8] Valverde, R A, Clark C A, Valkonen J P T. Viruses and virus disease complexes of sweet potato [J]. Plant Viruses, 2007, 1(1): 116-126.

[9] Alvinm S, Ling Kaishu, Howard H F, et al.Sweetpotatoleafcurlvirus: Efficiency of acquisition, retention and transmission byBemisiatabaci(Hemiptera: Aleyrodidae) [J]. Crop Protection, 2009, 28(11): 1007-1011.

[10]Lotrakul P, Valverde R A, Clark C A, et al. Detection of a geminivirus infecting sweet potato in the United States [J]. Plant Disease, 2007, 82(11): 1253-1257.

[11]王向阳. 广西胜红蓟黄脉病样中发现多种菜豆金色花叶病毒属的病毒[J]. 植物病理学报, 2007, 37(6): 679-682.

[12]周雪平. 双生病毒种类鉴定、分子变异及致病机理研究[C]∥ 中国植物保护学会2015年学术年会, 2015.

[13]Moriones E, Navas-Castillo J.Tomatoyellowleafcurlvirus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide [J]. Virus Research, 2000, 71(1/2): 123-134.

[14]Harrison B D, Swanson M M, Fargette D.Begomoviruscoat protein: serology, variation and functions [J]. Physiological & Molecular Plant Pathology, 2002, 60(5): 257-271.

[15]Rojas M R, Jiang Hao, Salati R, et al. Functional analysis of proteins involved in movement of the monopartite begomovirus,Tomatoyellowleafcurlvirus[J]. Virology, 2001, 291(1): 110-125.

[16]Bmugiira R B, Wu Jianbing, Wu Zujian, et al. Molecular characterization ofMalvastrumleafcurlGuangdongvirusisolated from Fujian, China [J]. 植物病理学报, 2008, 38(3): 258-262.

[17]Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA 6: Molecular evolutionary genetics analysis Version 6.0 [J]. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30(12): 2725-2729.

[18]Fauquet C M, Bisaro D M, Briddon R W, et al. Revision of taxonomic criteria for species demarcation in the familyGeminiviridae, and an updated list of begomovirus species [J]. Archives of Virology, 2003, 148(2): 405-421.

[19]Glick E, Levy Y, Gafni Y. The viral etiology of tomato yellow leaf curl disease-a review [J]. Plant Protection Science, 2009, 45(3): 81-97.

[20]苗相伟. 番茄黄化曲叶病毒病的研究进展[J]. 中国果菜, 2017(3):31-35.

[21]汤亚飞, 何自福, 杜振国,等. 番茄黄化曲叶病毒在湖北首次报道[J]. 植物保护, 2015,41(5):233-236.

[22]徐德利, 杨静, 鲍继友, 等. 番茄黄化曲叶病毒病综合防控技术研究进展[J]. 农业科技通讯, 2014(9): 254-257.

[23]Cheglakov Z, Weizmann Y, Basnar B, et al. Diagnosing viruses by the rolling circle amplified synthesis of DNAzymes [J]. Organic & Biomolecular Chemistry, 2007, 5(2): 223-225.

[24]Johne R, Müller H, Rector A, et al. Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase [J]. Trends in Microbiology, 2009, 17(5): 205-211.

(责任编辑：杨明丽)

Molecular identification of geminiviruses on tomato and morning glory in Hunan Province

Ban Yiyun, Ding Bo, Zhou Xueping

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Geminiviruses including a group of single-stranded circular DNA viruses occurred worldwide. Six plant samples collected from Hunan Province with symptoms of suspicious geminivirus infection were examined in this study. After conducting rolling circle amplification (RCA), the RCA products were digested by restriction endonuclease. Sequencing analysis revealed that virus isolates from tomato and morning glory shared 99% of homology withTomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV) andSweetpotatoleafcurlvirus(SPLCV), respectively. These results indicated that tomato and morning glory plants were infected by monopartite geminivirus, and this is the first report of geminivirus infection in Hunan Province.

Tomatoyellowleafcurlvirus;Sweetpotatoleafcurlvirus; DNA-A