樱桃褐斑病病原菌生物学特性及品种抗性评价

孙 杨, 付全娟, 孙玉刚, 魏国琴, 杨兴华

(山东省果树研究所, 泰安 271000)



樱桃褐斑病病原菌生物学特性及品种抗性评价

孙 杨, 付全娟, 孙玉刚, 魏国琴, 杨兴华

(山东省果树研究所, 泰安 271000)

研究了樱桃褐斑病病原菌的生物学特性,评价了39个樱桃品种对褐斑病田间抗病能力。结果表明,燕麦培养基和PCDA培养基最适于病菌生长;该病菌在10～35℃均能生长,25℃为最适生长温度;葡萄糖和蛋白胨是适宜病菌生长的碳、氮源;病菌有较广的酸碱度适应范围,在pH4～12均能生长,在pH7条件下生长速度最快;不同光照条件下,黑暗时菌丝生长速度最快;分生孢子在10～35℃均能萌发,最适温度为25℃;在pH7时分生孢子萌发率最高。不同樱桃品种对褐斑病的抗病性存在差异,39个品种中高抗品种6个,抗病品种12个,中抗品种9个,感病品种8个,高感品种4个,无免疫品种。

樱桃褐斑病; 核果钉孢菌; 生物学特性; 抗病性

樱桃Prunusavium营养丰富,酸甜适口,素有“春果第一枝”的美誉[1]。近年来,樱桃种植规模逐年扩大,樱桃褐斑病的发生呈明显加重趋势,在山东[2]、陕西[3]、四川[4]等樱桃主产区均有发生,严重制约樱桃产业的发展,成为樱桃生产上亟待解决的问题[5]。

樱桃褐斑病发生严重时,多个病斑愈合,病斑干化造成叶片穿孔、提早脱落,光合效率下降,树势衰弱,抗寒性降低,导致翌年产量下降[6]。樱桃褐斑病的病原菌为核果钉孢菌Passaloracircumscissa[7]。目前,国内外对樱桃品种抗病性评价的文献报道较少,而病原菌的生物学特性尚无研究报道,本研究对分离的核果钉孢菌,开展生物学特性研究,并对39个樱桃品种进行了田间抗病性评价,旨在为病害的发生规律和综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

于山东省果树研究所天平湖实验基地樱桃园内采集病叶,用单孢分离法分离、纯化菌株后,保存于山东省果树研究所中心实验室,备用。

1.1.2 供试培养基

樱桃叶煎汁葡萄糖培养基(FcheDA)、燕麦培养基(OA)、玉米粉培养基(CMA)、樱桃叶煎汁培养基(FcheA)、马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、马铃薯蔗糖培养基(PSA)、马铃薯胡萝卜葡萄糖培养基(PCDA)、V8培养基(V8汁200 g、CaCO33.0 g、琼脂20.0 g、蒸馏水1 000 mL)、胡萝卜葡萄糖培养基(CDA)、查氏培养基(Czapek)。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌生物学特性研究

1.2.1.1 不同培养基对菌丝生长的影响

以FcheDA、OA、CMA、FcheA、PDA、PSA、PCDA、V8、CDA、查氏10种培养基作为培养基质。将供试菌株在PDA平板培养15 d后,在菌落边缘用无菌打孔器切取直径5 mm的菌饼,接种到直径9 cm的培养基平板中央,每皿放置1个菌饼(下同)。每处理3次重复。于25℃恒温培养30 d,用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.1.2 不同碳源、氮源对菌丝生长的影响

以Czapek培养基为基础培养基,将蔗糖分别用等量的葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、半乳糖、木糖置换,以无碳源的Czapek培养基为对照;将KNO3分别替换为蛋白胨、NaNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4、牛肉浸膏、酵母浸膏,以无氮源的Czapek为对照,将菌饼接种到不同碳、氮源培养基,每处理3次重复。于25℃恒温培养30 d,用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.1.3 pH对菌丝生长的影响

用1 mol/L的HCl和NaOH将PDA培养基的pH调节至4、5、6、7、8、9、10、11、12共10个梯度。分别接种5 mm病原菌菌饼后25℃条件下恒温培养30 d。用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.1.4 温度对菌丝生长的影响

设定5、10、15、20、25、30、35℃共7个温度梯度。在供试的PDA培养基上接种直径5 mm的病原菌菌饼,在培养箱中连续培养30 d。每处理3次重复。用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.1.5 光照对菌丝生长的影响

设连续光照、L∥D=12 h∥12 h、连续黑暗3个处理。供试培养基为PDA培养基,将直径5 mm的菌饼,接种于PDA培养基平板中央,25℃恒温培养箱中培养30 d,十字交叉法测量菌落直径。

1.2.1.6 分生孢子悬液的制备

从樱桃园采集具有典型症状的新鲜病叶,放入装有冰袋的保鲜盒中带回实验室,用自来水将表面冲洗干净后用灭菌的去离子水冲洗3遍,保湿。在10×4.5倍解剖镜(Nikon)下用灭菌的解剖刀将分生孢子堆挑下,用无菌水配成孢子悬浮液,然后在10×10的低倍镜(Leica)下检查孢子数,用无菌水调节至20个孢子/视野。

1.2.1.7 温度对分生孢子萌发的影响

采用凹载玻片萌发法,将调节好浓度的孢子悬液滴于载玻片上,将其放入垫有湿滤纸的培养皿内,分别置于5、10、15、20、25、30、35℃的培养箱内保湿培养,每处理3次重复,12 h后计数孢子总数和萌发孢子数,计算孢子萌发率。

1.2.1.8 pH对分生孢子萌发的影响

用1 mol/L的HCl和NaOH溶液调节无菌水pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,配制孢子悬浮液,采用凹玻片萌发法,置于25℃条件下保湿培养,每处理3次重复,12 h后测定孢子萌发率。

1.2.2 品种抗病性评价

1.2.2.1 调查品种

樱桃树为位于山东省果树研究所天平湖实验基地内6年生嫁接品种,株行距为2 m×4.5 m,树势中庸。共调查39个品种。

1.2.2.2 调查方法

每个品种选择3株长势一致的植株,每株东南西北4个方向取200片叶,调查叶斑病发病情况并进行分级(表1),计算病情指数。

表1 樱桃褐斑病叶部病斑分级标准

Table 1 The classification standards for cherry leaf spot

病级Grade分级标准Standard0无病斑1叶片病斑较少,病斑面积占整个叶面积的1%～10%3病斑较多,病斑面积占整个叶面积的11%～20%5病斑较多,病斑面积占整个叶面积的21%～30%7病斑多,病斑面积占整个叶面积的31%～50%9病斑多或融合成大斑,病斑面积占整个叶面积的50%以上

相对抗病指数=鉴定品种病情指数/对照品种病情指数(以病情指数最高的品种为对照品种)。

褐斑病发病程度按以下标准:“+”表示偶尔发生;“++”表示经常或局部发生;“+++”表示普遍发生;“++++”表示严重发生;“+++++”表示特别严重发生。

抗病性按以下标准:“xxxxx”表示抗病性高;“xxxx”表示抗病性较高;“xxx”表示抗病性一般;“xx”表示较感病;“x”表示易感病。

以病情指数为基础,采用相对抗病性评价其抗病程度,根据相对抗病指数进行抗性划分。抗性水平分为:免疫(I)为1.00、高抗(HR)为0.80～0.99、抗病(R)为0.70～0.79、中抗(MR)为0.50～0.69、感病(S)为0.30～0.49、高感(HS)为0～0.29。

1.2.3 数据分析方法

采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析。处理间差异显著性分析(P<0.05)采用Duncan’s新复极差法。

2 结果与分析

2.1 病菌生物学特性

2.1.1 不同培养基对菌丝生长的影响

病原菌在不同培养基上均能生长,在燕麦培养基、PCDA培养基上生长速度最快,其次为PDA、查氏培养基,在玉米粉培养基、V8汁培养基上生长速度最慢(图1)。

图1 不同培养基上菌丝生长情况Fig.1 Effects of culture media on mycelial growth

2.1.2 不同pH对菌丝生长的影响

病原菌在pH 4～12的情况下均能生长,在pH为4时生长最慢,在pH为7时生长最快,在pH为6～9时均适合菌丝生长(图2)。

图2 不同pH条件下菌丝生长情况Fig.2 Effects of pH on mycelial growth

2.1.3 不同碳源对菌丝生长的影响

病原菌适宜碳源为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖,最适碳源为葡萄糖、麦芽糖,不适宜碳源为甘露醇、木糖(图3)。

图3 不同碳源条件下菌丝生长情况Fig.3 Effects of carbon sources on mycelial growth

2.1.4 不同氮源对菌丝生长的影响

病原菌适宜氮源为牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏,最适氮源为牛肉浸膏、蛋白胨,在硫酸铵培养基中生长最为缓慢(图4)。在无氮源生长条件下，菌丝生长稀疏，只有单根菌丝向外生长速度快，因此不作为最佳培养条件。

图4 不同氮源条件下菌丝生长情况Fig.4 Effects of nitrogen sources on mycelial growth

2.1.5 不同温度对菌丝生长的影响

随着温度的上升,菌丝生长速度呈先加快后减慢的趋势,病原菌适宜生长温度为25～30℃,35℃生长速度明显减缓(图5)。

图5 不同温度条件下菌丝生长情况Fig.5 Effects of temperature on mycelial growth

2.1.6 不同光照条件对菌丝生长的影响

在黑暗条件下,菌丝生长速度最快,在全光照条件下,菌丝生长速度最慢,与黑暗和光暗交替条件下相比,差异达到显著水平(P<0.05)(图6)。

图6 不同光照条件下菌丝生长情况Fig.6 Effects of illumination on mycelial growth

2.1.7 不同温度对孢子萌发率的影响

在10～35℃孢子均可萌发,随着温度的上升萌发率呈先上升后下降的趋势,在25℃时萌发率最高(图7)。

图7 不同温度条件下孢子的萌发率Fig.7 Effects of temperature on conidial germination rate

2.1.8 不同pH对孢子萌发率的影响

随着pH的升高,孢子萌发率呈先升高后降低的趋势,在pH为7时,萌发率达到最高值,随后下降,在pH为12时,萌发率最低(图8)。

图8 不同pH条件下孢子的萌发率Fig.8 Effects of pH on conidial germination rate

2.2 品种抗性评价

以病情指数为基础,采用相对抗病性方法评价其抗病程度,根据相对抗性指数进行抗性划分。39个樱桃品种的病情指数为7.6～62.9,平均为25.2;相对抗病指数为0～0.88,平均为0.60。病情指数是反映樱桃品种抗病性差异的重要指标,按照病情指数、相对抗性指数的大小,可将39个品种的抗病性分为6级,即免疫(I)、高抗(HR)、抗病(R)、中抗(MR)、感病(S)、高感(HS)。39个樱桃品种中无免疫品种,高抗品种为‘秦樱’、‘重庆乌皮’、‘格拉斯’、‘樱姬’、‘红清’、‘Sir Douglas’;抗病品种为‘早大果’、‘黑珍珠’、‘丽珠’、‘13-33’、‘鲁玉’、‘秦林’、‘佳红’、‘斯坦拉’、‘大地红’、‘饴珠’、‘早露’、‘早红珠’;中抗品种为‘拉宾斯’、‘C2’、‘红蜜’、‘泰珠’、‘明珠’、‘先锋’、‘萨米脱’、‘布鲁克斯’、‘红灯’;感病品种为‘美早’、‘彩玉’、‘C1’、‘雷尼’、‘晚红珠’、‘红艳’、‘岱玉’、‘桑提娜’;高感品种为‘意早’、‘吉美’、‘红手球’、‘Red’(表2)。

表2 樱桃品种特性及其对樱桃褐斑病的抗性

Table 2 Investigation of cherry cultivar characteristics and resistance to cherry leaf spot

品种Variety地区Area果实形状Shape果实颜色Color成熟时间Ripeningperiod病情指数Diseaseindex相对抗病指数Relativediseaseresistanceindex抗病性Diseaseresistance发病程度Morbiditydegree抗性评价Resistanceevaluation重庆乌皮中国圆形浅红色5月上中旬7.60.88xxxxx+HR秦樱中国心脏形紫红色5月中旬7.70.88xxxxx+HR樱姬日本心脏形红色6月上旬7.70.88xxxxx+HRSirDouglas新西兰宽心脏形红色6月上旬8.70.86xxxxx+HR格拉斯俄罗斯宽心脏形红色5月底8.70.86xxxxx+HR红清日本心脏形红色5月下旬9.10.86xxxxx+HR佳红中国心脏形浅黄色5月底至6月初12.70.80xxxx++R早露中国宽心脏形紫红色5月中旬12.70.80xxxx++R13-33中国宽心脏形黄色5月底至6月初13.80.78xxxx++R斯坦拉加拿大心脏形紫红色6月上旬13.90.78xxxx++R黑珍珠中国宽心脏形紫红色5月下旬14.20.77xxxx++R早红珠中国宽心脏形紫红色5月下旬14.20.77xxx+++R早大果乌克兰宽心脏形深红色5月中下旬15.80.75xxxx++R

续表2 Table 2(Continued)

品种Variety地区Area果实形状Shape果实颜色Color成熟时间Ripeningperiod病情指数Diseaseindex相对抗病指数Relativediseaseresistanceindex抗病性Diseaseresistance发病程度Morbiditydegree抗性评价Resistanceevaluation秦林美国宽心脏形紫红色5月下旬16.00.75xxxx++R丽珠中国肾脏形紫红色6月上旬16.10.74xxxx++R鲁玉中国肾脏形紫红色5月底至6月初17.70.72xxxx++R大地红日本短心脏形红色5月中下旬17.70.72xxxx++R饴珠中国宽心脏形黄底红晕6月上旬18.90.70xxxx++R红灯中国肾脏形紫红色5月下旬20.30.68xxx+++MR明珠中国宽心脏形红底黄晕5月下旬23.20.63xxx+++MR泰珠中国肾脏形紫红色6月上旬23.40.63xxx+++MRC2中国心脏形紫红色6月初23.60.62xxx+++MR先锋美国肾脏形深红色6月上中旬25.20.60xxx+++MR拉宾斯加拿大卵圆形紫红色6月上中旬26.30.58xxx+++MR萨米脱美国心脏形紫红色6月上旬26.40.58xxx+++MR红蜜中国心脏形黄底红晕5月下旬27.40.56xxx+++MR布鲁克斯美国心脏形红色5月下旬28.30.55xxx+++MR岱玉中国心脏形紫红色6月初31.40.50xx++++S红艳中国宽心脏形红色5月下旬31.40.49xx++++S彩玉中国近圆形黄底红晕5月底32.30.49xx++++S桑提娜加拿大心脏形红色至紫红色5月下旬34.30.45xx++++S晚红珠中国宽心脏形红色6月中旬34.30.45xx++++S美早美国肾脏形紫红色5月下旬35.30.44xx++++SC1中国扁圆形紫红色6月上旬35.70.43xx++++S雷尼美国宽心脏形黄底红晕6月上旬38.10.39xx++++S吉美中国心脏形紫红色6月上旬54.30.14x+++++HSRed新西兰宽心脏形紫红色6月上旬55.20.12x+++++HS红手球日本短心脏形红色6月上旬61.80.02x+++++HS意早法国短心脏形紫红色5月底62.90xx++++HS

3 讨论

尾孢菌属真菌有许多是重要的植物病原真菌,且绝大多数具有很强的寄生性[8],人工培养和产孢条件难以确定,即使是分离后能在人工培养基上生长,其生长速度也非常缓慢,而且很难产生孢子,这制约了对尾孢属真菌的系统研究。本研究中,核果钉孢菌最适宜的生长条件为25℃,黑暗,PCDA培养基,以葡萄糖为碳源。本文通过对樱桃褐斑病菌生物学特性的研究,阐明了病菌生长和环境条件的关系,进一步明确了病害的发生规律,为病害的深入研究和防治提供了一定的理论基础。

褐斑病是樱桃生产中常见的病害,喷施化学药剂是防治该病害的主要措施,但化学药剂容易造成环境污染,且易导致病原菌产生抗药性。选育抗病品种是病害防治的有效措施。品种抗性评价是抗病育种的基础工作,为抗病育种提供理论支持。本研究中,不同樱桃品种对褐斑病的抗性存在差异,按照病情指数、相对抗病指数可分为免疫、高抗、抗病、中抗、较感病、感病6个等级,在调查的39个品种中,‘秦樱’、‘重庆乌皮’、格拉斯、‘樱姬’、‘红清’、‘Sir Douglas’为高抗品种,而‘意早’、‘吉美’、‘红手球’、‘Red’为高感品种。病害抗性调查是评价品种抗病性的重要指标,但即使是在同等发病条件下,不同年份、不同地区以及不同树势,会使品种间存在相对抗性差异。在实际育种中,除筛选出优良的抗病品种、进行种间杂交外,还应进一步找出抗病品种的抗病基因,提升选育品种的抗性。

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(责任编辑：田 喆)

Identification of cherry cultivar resistance to leaf spot and biological characteristics ofPassaloracircumscissa

Sun Yang, Fu Quanjuan, Sun Yugang, Wei Guoqin, Yang Xinghua

(InstituteofShandongPomology,Tai’an271000,China)

The biological characteristics ofPassaloracircumscissaisolated from Tai’an and the resistance of 39 cherry varieties in the field were studied. The results showed that OA and PCDA were the optimum culture media for pathogen growth. The optimum temperature was 25℃ (10 to 35℃). Glucose and peptone were the optimum carbon and nitrogen sources. The pathogen adapted to a wide range of pH values, growing well from pH 4 to pH12, and the optimum pH value was 7. The mycelium grew faster in darkness. For germination of conidia, the optimum temperature and pH were 25℃ and 7, respectively. Different varieties exhibited different disease resistances, including six highly resistant varieties,12 resistant varieties, 9 moderately resistant varieties, 8 susceptible varieties, 4 highly susceptible varieties, and immune varieties were not found.

cherry leaf spot;Passaloracircumscissa; biological character; resistance

2016-10-19

2017-02-08

山东省自然科学基金培养基金(ZR2014CP017)

S 436.62

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.020

联系方式 E-mail: sunyang_729@163.com