两种板栗重要蛀果象甲鉴别研究

肖云丽, 张 帆, 徐艳霞, 钟玉林

(经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室,大别山特色资源开发湖北省协同创新中心,黄冈师范学院生命科学学院, 黄冈 438000)



两种板栗重要蛀果象甲鉴别研究

肖云丽, 张 帆, 徐艳霞, 钟玉林*

(经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室,大别山特色资源开发湖北省协同创新中心,黄冈师范学院生命科学学院, 黄冈 438000)

栗雪片象NiphadescastaneaChao和栗实象CurculiodavidiFairmaire幼虫形态相似,均蛀食板栗果实,是严重影响板栗产量或质量的重要害虫。为快速准确地鉴别这两种害虫,采用野外调查法和室内饲养法,对两种蛀果象甲的形态学和生态学特性进行了观察描述;同时对基于线粒体COⅠ基因片段的DNA条形码序列进行了提取扩增与分析。结果表明:栗雪片象和栗实象在成虫形态、为害特性和生活习性上差异明显; DNA条形码序列(COⅠ基因5′端684 bp)可作为两种板栗蛀果象甲鉴定的分子标记,两者具有明显的碱基差异,遗传距离达18.9%～19.6%,在系统发育关系上,栗雪片象与Molytinae亚科的Niphadomimussp. 聚为一支,栗实象与Curculio属3个种聚为一支。研究结果可为两种板栗蛀果象甲幼虫的鉴别提供可靠依据,为象甲科昆虫的进一步研究提供形态、生态和分子证据。

板栗雪片象; 栗实象; 形态特征; 为害特性; 生活习性; DNA条形码序列; COⅠ基因

板栗CastaneamollissimaBlume为山毛榉科栗属植物,是我国栽培最早的经济树种和重要干果之一,主要生长或栽培于山地、丘陵地带,地理环境复杂,植食性昆虫的种类也非常丰富。近年来,不少学者对我国各地板栗害虫进行了调查研究,共计10目118科818种[1-3]。其中蛀果象甲栗雪片象NiphadescastaneaChao和栗实象CurculiodavidiFairmaire广泛分布于我国各板栗生产区,在长期的进化过程中,其形态、生理和生态习性等与寄主植物板栗高度适应,在栗果膨胀期和栗果成熟期前后以特定的方式致使板栗提前落果,蛀食栗果并滋病腐烂,在不少板栗产区猖獗为害,成为严重影响板栗产量和质量的重要害虫[4-5]。如在湖北省罗田县栗园,栗实象和栗雪片象致栗果被害率达20%～60%[5-6]。

栗雪片象和栗实象隶属鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae。象甲科是动物界最大的科之一,世界已记载5万种,分布遍及全球[7],主要为害花木果树,幼虫钻入植物的根、茎、叶或谷粒、豆类中蛀食,是经济作物上的大害虫,但幼虫均体色单一,乳白色或黄白色,躯体通常呈“C”形弯曲,难以鉴别。栗雪片象和栗实象常共同分布于我国板栗生产区,幼虫均蛀食栗果,本研究主要对这两种板栗蛀果象甲的成虫、幼虫的形态学和生活习性进行了详细描述,同时基于COⅠ基因片段序列,对两种蛀果象甲的DNA条形码序列进行了比较分析,研究结果可望为两种板栗蛀果象甲的快速、准确鉴定提供技术支持,为形态和分子系统发育研究提供更多证据,具有一定的理论意义和实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

栗雪片象和栗实象成虫于发生期在栗园通过搜捕法获得。于栗果膨胀期捡拾板栗落果,解剖获取板栗雪片象幼虫(落果捡回室内饲养获取部分成虫);于板栗采收后捡拾出果幼虫,获取栗实象幼虫(带回室内饲养获取部分成虫)。幼虫样品浸泡在100%乙醇中常温保存用于DNA提取备用。所有照片均由佳能单反相机(Canon EOS 70D)拍摄。

1.2 方法

1.2.1 昆虫基因组的DNA提取

样品预处理:将无水乙醇浸制幼虫标本置于装有无菌水的离心管中浸泡3 h,其间更换无菌水3次,更换前用超声波清洗器清除表面污物,每次30 s。

按DNA提取试剂盒E.Z.N.A.Insect DNA Kit试剂盒操作方法提取栗雪片象和栗实象幼虫(取胸腹部3～4 mm长表皮)基因组DNA。

1.2.2 DNA条形码片段PCR扩增与测序

以动物DNA条形码通用引物LCO1490:5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′为上游引物,HCO2198:5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′为下游引物,扩增DNA条形码COⅠ基因5′ 端片段[8],引物由武汉金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR扩增采用50 μL反应体系:PremixTaq25 μL,模板DNA 3 μL,上下游引物各1.5 μL,加ddH2O至50 μL。PCR反应程序设定为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,58℃退火40 s,72℃延伸2 min,反应重复1次,35个循环;72℃延伸10 min后4℃(或10℃)保存。扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测,将检测合格的样品送交上海生工生物公司武汉分公司进行双向测序。

1.2.3 序列数据分析

利用SeqMan软件对序列进行拼接和校正,结合Chromas 2.4软件查看测序峰图,进行人工修改,去掉前后峰图不稳定的序列,保存为Fasta格式。在GenBank中进行Blast搜索比对,验证是否为目标序列,并下载同源序列和外群序列。

利用MAGE 6.0 程序对DNA序列进行比对、遗传距离分析和基于邻接法(NJ)进行系统发育关系分析。

2 结果

2.1 两种板栗蛀果象甲的形态学与生态学特性

2.1.1 栗雪片象形态学与生态学特性

形态特征:成虫(图1a)体长7.0～10.5 mm,暗褐色,被黄白色鳞片。头部和喙散布粗刻点,喙黑色,较粗,喙与体长之比约为0.25∶1;触角着生于喙端部1/3处,红褐色,膝状,11节,柄节约为触角总长的1/2,末端3节棒状。前胸黑色,宽略大于长,两侧拱圆,前后缘略突出,密被珠状瘤,中间前半端有明显的隆线。鞘翅浅黑褐色,密被黄白色鳞片,在基部2/3形成黄白色小斑点、端部1/3形成黄白色大斑;行纹窄浅,密具刻点,行间3、5、7各有一行较大的瘤。腹部和足密被黄白色毛状鳞片,腿节端部1/3处鳞片密集成环,腿节后端1/3有一钝齿。成熟幼虫(图1c～d)体长8.0～12.5 mm,乳白色,略呈C形弯曲。

主要为害时期及方式:栗仁形成期至膨大期;幼虫蛀食果柄处栗苞致幼果脱落(图1b,e),影响板栗产量。

生活习性:成虫5月底开始在花絮、嫩芽和栗叶背面取食,后取食幼嫩栗苞或果柄,并产卵于栗苞上;成虫具有假死习性,受到惊扰后立即落地不动,飞行能力较差,只能做短距离飞行。幼虫先沿果柄蛀入栗苞内,蛀食栗苞并进一步蛀食栗仁,使其内充满颗粒状虫粪,幼虫在栗苞或栗果内(捣碎种皮呈絮状)越冬化蛹(图1b～d);1年1代。

图1 栗雪片象Fig.1 Niphades castanea

2.1.2 栗实象形态学与生态学特性

形态特征:成虫(图2a～b)体长6.9～9.2 mm,体黑褐色。雌虫喙与体长之比约为90∶82,雄虫约为51∶72;触角着生于喙基部1/2处(雄性)或1/3处(雌性),膝状,11节,柄节约为触角长的3/7,末端3节膨大呈球棒状。前胸背板宽略大于长,被稀疏白色短毛,后缘外侧具1条白色鳞片带。鞘翅基部和外缘2/5处各具1条白色鳞片短横带,翅2/3处具1条白色鳞片长横带,从鞘翅缝基部至1/2处或延至后缘端部具1条不连续的纵向白色鳞片带;腹板黑褐色,密被白色鳞片;足细而长,密被白色鳞毛,腿节近末端具1个宽而尖的齿,与胫节相扣夹持苞刺。幼虫体长8.0～12.0 mm,乳白色,C形弯曲(图2c)。

主要为害时期及方式:栗仁膨大期至成熟期前后;幼虫蛀食栗仁和引发病菌感染(图2c),影响板栗产量和质量。

生活习性:在罗田栗园,成虫于7月底开始出现,一直持续到9月底板栗晚熟品种采收之后,具有假死习性,受到惊扰后立即落地不动,飞行能力较差,只能做短距离飞行。产卵时先用口器刺破栗苞与种皮后(图2b),产卵1～3粒于栗仁内,幼虫孵化后一直在取食栗仁,使栗果内充满颗粒状虫粪,导致板栗失去食用价值,待幼虫成熟后再破洞钻出并入土越冬化蛹(图2c～e);1～2年1代。

2.2 两种板栗蛀果象甲COⅠ基因序列分析

2.2.1 目标序列的确定

两种象甲的COⅠ基因的测序结果经拼接校对后,最后获得5′端684 bp的片段序列,将校对序列在GenBank进行BLAST检索,结果显示,栗雪片象与同亚科Molytinae中Niphadomimussp.相似性达85%,栗实象与同属的叶脉象Curculiovenosus、欧洲栗象C.elephas和锡金象C.sikkimensis相似性达89%～90%,可以确认试验所得基因片段为目标序列。所有序列均提交至GenBank数据库中,其中板栗雪片象的Accession登录号为KX774484、KX774485、KX774486,分别来自LT15026、LT15027、LT15028幼虫样本;栗实象的Accession登录号为KX774487、KX774488,分别来自LT15035、LT15036幼虫样本。

2.2.2 遗传距离与系统发育分析

以步甲科达步甲Damastermirabilissimus和星步甲Calosomasp.为外群,利用MAGE6.0对两种象甲的目标序列与GenBank数据库中BLAST检索所得的同源序列(表1)构建遗传距离表(表2),并基于邻接法(经Kimura-2距离校正,执行Bootstrap 1 000次)构建系统发育树(图3)。

图2 栗实象Fig.2 Curculio davidi

物种Species科Family亚科SubfamilyGenBank登录号GenBankaccessionno.NiphadescastaneaLT15026CurculionidaeMolytinae试验获取NiphadescastaneaLT15027CurculionidaeMolytinae试验获取NiphadescastaneaLT15028CurculionidaeMolytinae试验获取CurculiodavidiLT15035CurculionidaeCurculioninae试验获取C.davidiLT15036CurculionidaeCurculioninae试验获取Niphadomimussp.6VG-2014CurculionidaeMolytinaeKJ427737.1Niphadomimussp.3VG-2014CurculionidaeMolytinaeKJ427734.1Niphadomimussp.1VG-2014CurculionidaeMolytinaeKJ427749.1Artipussp.1AMV2011aCurculionidaeEntiminaeHQ891429.1CurculioelephasCurculionidaeCurculioninaeKM450966.1CurculiovenosusCurculionidaeCurculioninaeKM442627.1CurculiosikkimensisCurculionidaeCurculioninaeKC135935.1Lachnopussp.GZ12CurculionidaeEntiminaeKT350633.1Lachnopussp.4AMV2011dCurculionidaeEntiminaeHQ891469.1LachnopusseiniCurculionidaeEntiminaeHQ891465.1Baridinaesp.1ACP-2013CurculionidaeBaridinaeKF946344.1EucryptorrhynchusbrandtiCurculionidaeCryptorrhychinaeKR088970.1DamastermirabilissimusCarabidaeCarabinaeGQ344500.1Calosomasp.BYU-CO241CarabidaeCarabinaeGU176340.1

结果显示,栗雪片象种内遗传距离为0～0.3%,栗实象种内遗传距离为0.2%,两者种间遗传距离为18.9%～19.6%,具有明显的种间差异。板栗雪片象与Molytinae亚科的Niphadomimussp. 聚为一支,遗传距离为17.0%～17.6%;4种Curculio象甲聚为一支,栗实象与Curculioelephas、C.venosus和C.sikkimensis的遗传距离分别为12.1%～12.3%、10.7%～10.8%和12.1%～12.3%。

表2 基于COⅠ基因片段序列的种间遗传距离

Table 2 Species genetic distances based on COⅠ gene segment sequences

12345678910111213141516171.Lachnopussp.GZ122.Baridinaesp.1ACP-20130.1993.Lachnopusseini0.1490.1934.Artipussp.1AMV2011a0.1720.1970.1475.Calosomasp.BYU-CO2410.2400.2270.2030.2126.Damastermirabilissimus0.2290.2350.2160.2020.1257.Curculioelephas0.2160.1640.2080.2120.2370.2618.Curculiovenosus0.2120.1580.1750.1890.2440.2550.1219.Curculiosikkimensis0.2180.1530.1930.2020.2430.2530.1460.12310.Niphadomimussp.1VG-20140.2000.1940.1980.1950.2320.2400.1800.1780.18611.Niphadomimussp.3VG-20140.2080.1780.1890.1820.2420.2390.1900.1720.1840.10712.Niphadomimussp.6VG-20140.2340.1840.2080.2030.2460.2710.2090.2050.2130.1310.11813.NiphadescastaneaLT150260.2000.1760.2140.1960.2550.2590.2080.2040.1900.1740.1760.17414.NiphadescastaneaLT150270.2000.1760.2140.1960.2550.2590.2080.2040.1900.1740.1760.1740.00015.NiphadescastaneaLT150280.1980.1720.2090.1940.2530.2570.2060.2040.1880.1720.1760.1700.0030.00316.CurculiodavidiLT150350.2180.1350.1720.1840.2370.2290.1210.1070.1210.1740.1920.1900.1940.1940.18917.CurculiodavidiLT150360.2200.1370.1740.1860.2390.2310.1230.1030.1230.1760.1940.1830.1960.1960.1910.002

图3 基于COⅠ基因片段的NJ树(经Kimura-2距离校正)Fig.3 NJ tree based on COⅠ gene segment sequences (Kimura-2 distance correction)

3 结论与讨论

栗雪片象和栗实象幼虫形态相似,均蛀食板栗果实,但两者在成虫形态、为害和生态习性上具有明显的差异。

栗雪片象:成虫体暗褐色,喙粗短,鞘翅基部2/3具黄白色小斑点、端部1/3具黄白色大斑;成虫早在开花期羽化出土,卵产于果柄处栗苞内,幼虫孵化后蛀食果柄处栗苞,引发板栗提前落果,有些随后进一步钻破果皮进入栗仁取食,幼虫在果柄处栗苞或栗仁内越冬。

栗实象:成虫体黑褐色,喙细长,鞘翅基部、外缘2/5处和翅2/3处具3条白色横带;成虫于栗仁膨大期羽化出土,产卵于栗仁内,幼虫孵化后取食栗仁,幼虫成熟后在坚硬果皮上蛀一圆形孔洞,钻出入土越冬。

有研究表明,栗实象在早期为害栗果往往引起栗果脱落,而在晚期受害果则不脱落[9-11],根据栗实象的为害特性,即成虫产卵于栗实内、幼虫在栗实内取食,并未妨碍营养物质及水分从果柄向栗苞运输,栗苞及栗苞内果实仍可膨大生长,且栗实象羽化出土相对较晚。因此,早先报道栗果提前脱落可能是由栗雪片象幼虫为害引起的,栗实象幼虫是否引发栗果早期脱落有待进一步研究证实。

板栗雪片象和栗实象DNA条形码序列(COⅠ基因5′端684 bp)的遗传距离高达18.9%～19.6%,碱基差异明显。板栗雪片象与Molytinae亚科的Niphadomimussp. 聚为一支,遗传距离为17.0%～17.6%;栗实象与同属的3种聚为一支,遗传距离为10.6%～12.1%,具有较近的亲缘关系,但在GenBank数据库中未发现与两种象甲遗传距离更小的序列。目前,全世界已知象甲科昆虫5万种[7],但BOLD数据库中仅记载象甲科昆虫2 571个已命名种的DNA条形码COⅠ基因片段序列[12],有待大量开展象甲科昆虫的DNA条形码序列研究,为象甲科害虫尤其是幼虫的快速准确鉴定提供技术支持。

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[12]DNA barcode of life data[DB/OL].BOLD, 2016, http:∥www.boldsystems.org.

(责任编辑：田 喆)

Discrimination of two chestnut fruit borer weevils (Coleoptera: Curculionidae)

Xiao Yunli, Zhang Fan, Xu Yanxia, Zhong Yulin

(HubeiKeyLaboratoryofEconomicForestGermplasmImprovementandComprehensiveUtilizationofResources,HubeiCollaborativeInnovationCenterfortheCharacteristicResourcesExploitationofDabieMountains,CollegeofLifeSciences,HuanggangNormalUniversity,Huanggang438000,China)

The larvae of two weevils,NiphadescastaneaChao andCurculiodavidiFairmaire, are similar in morphology, and both bore and feed chestnut fruits, seriously affecting the yield and quality of chestnut production. To identify these two pests quickly and accurately, the morphological and ecological characteristics of the two fruit borer weevils were described based on the field survey and indoor breeding method; at the same time, the DNA barcode,i.e., mitochondrial COⅠ gene fragment sequence, was analyzed. Obvious differences existed in adult morphology, damage characters and living habits betweenN.castaneaandC.davidi; the DNA barcode sequence of COⅠ gene fragment, as a molecular marker, could discriminate the two chestnut fruit borer weevils, with obvious difference among the 684 bp COⅠ gene fragment, and the genetic distance reached 18.9%-19.6%. In the phylogenetic tree,N.castaneawas clustered withNiphadomimussp., andC.davidiwas clustered withC.elephas,C.venosusandC.sikkimensis. These data provide a tool for distinguishing the two chestnut fruit borer weevils, and the morphological, ecological, and molecular evidences help for the further study of curculionidae insects.

Niphadescastanea;Curculiodavidi; morphological character; damaging character; living habit; DNA barcode sequence; COⅠ gene

2016-09-20

2016-11-29

湖北省教育厅科学研究项目(D20152904);湖北省自然科学基金项目(2015CFA158);湖北省重点实验室项目(2013000703);湖北省协同创新中心创新团队项目(2015TD06)

S 433.5

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.019

* 通信作者 E-mail: swzyl@hgnu.edu.cn