一个嗜蓝孢孔菌属新菌株的分离、鉴定与菌种培养基质研究

2017-08-08郭尚周林徐莉娜

安徽农学通报 2017年14期

郭尚　周林　徐莉娜

摘要：采自山西右玉地区沙棘树腐木中的野生嗜蓝孢孔菌属一新菌株，其形态学特征为具有马蹄形担子果，盖状无柄，有时平伏反卷生长，单系菌丝系统；骨架菌丝在Melzer试剂和棉蓝试剂中呈负反应；担孢子近球形或球形，无色，厚壁等。将Fomitiporia yanbeiensis的ITS序列与其他已经报道的嗜蓝孢孔菌属真菌ITS进行比对分析。分析结果表明Fomitiporia yanbeiensis与嗜蓝孢孔菌属亲缘关系较近，因此可定该属的一个新种，名为 Fomitiporia yanbeiensis S. Guo & L. Zhou（GenBank： KT861405，Fungal name： FN570360）。

关键词：嗜蓝孢孔菌；新种；形态学；分类；培养基质

中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）14-0035-04

Abstract：A new Fomitiporia fungus，Fomitiporia sp. nov.，was collected from the Datong area （Youyu） Shanxi Province China in the wild sea buckthorn trees rot wood. The morphological feature is that it has a horseshoe shaped cover basidiocarps，sessile，sometimes procumbent backscroll mycelium growth，single system；skeletal hyphae showed a negative reaction in the Melzer reagent and cotton blue reagent；basidiospore near spherical or spherical，colorless，thick wall etc..The ITS sequence of Fomitiporia yanbeiensis was compared with the other species of ITS，which were reported. The results showed that Fomitiporia yanbeiensis had a close genetic relationship with the Fomitiporia species. It was an new species and was named Fomitiporia yanbeiensis S. Guo & L. Zhou （GenBank： KT861405，Fungal name： FN570360）.

Key words：Fomitiporia；New species；Morphology；Classification；Culture medium

嗜蓝孢孔菌（Fomitiporia）是担子菌门 Basidiomycota，伞菌亚门 Agaricomycotina，伞菌纲 Agaricomycetes，锈革孔菌目 Hymenochaetales 锈革孔菌科 Hymenochaetaceae 的一个属，随着形态学与分子生物学相结合研究技术的进步，对嗜蓝孢孔菌属Fomitiporia的研究也有了很大的进展，发现了许多新的分类单元[1-3]。

我们在研究山西省食药用菌种质资源的工作中，在山西大同地区的右玉县发现并采集到了一种生长在沙棘树上的木生真菌。通过对采集标本进行的形态学和ITS序列比对的分析研究发现，该菌是属于Fomitiporia属的一个种，并对该菌种的培养基质进行了试验，现将其结果概述如下。

1 材料和方法

1.1 材料的采集和菌株的保存课题组在山西右玉采集到了一种生长在沙棘树上的嗜蓝孢孔菌属真菌，采集人郭尚等，采集时间2015年10月，寄主为沙棘树（Hippophae rhamnoides Linn.），标本编号SXSYJBB1510，保存于山西省农业科学院食用菌研究所内。该标本采集地点海拔1352m，北纬39°98′、东经112°47′，这个地区的山脉是山西地区针阔叶林和混交林地带的生长处。以采集的新鲜沙棘腐木上的子实体，进行组织分离得到纯菌株，保存于山西省农科院食用菌所内（SXSYJJZ No.1510）和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC No.13380）。

1.2 菌丝分离与培养采用组织分离法，子实体整体用75%乙醇擦拭消毒后，在无菌条件下，用手术刀分别在菌盖、菌柄、菌褶、根部切取小块组织，分别接种于121℃灭菌30min的PDA培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1L）。将接种的培养基放置于27℃恒温培养箱中，每隔24h检查一次菌丝的生长情况。

1.3 形态学研究标本保存于山西省农业科学院食用菌研究所。肉眼观察标本的颜色、质地、形状、生长年限、平伏或有菌盖，菌盖是否有毛或环带等特征，然后用标尺测量子实体的长度、宽度和厚度。

在尼康E80i显微镜下利用Melzer、棉蓝和5%KOH三种试剂作切片浮载剂观察显微形状，包括：菌丝系统（单系或二系或三系、菌丝在棉蓝试剂中有无嗜蓝反应、在Melzer试剂中有无淀粉质反应或拟糊精反应、在5%KOH试剂中有无变化或反应、菌髓或菌肉菌丝的排列方式）；生殖菌丝（颜色、简单分隔或锁状联合、分隔常见或稀少、薄壁或厚壁、平直或弯曲、有无分支、菌髓或菌肉中生殖菌丝常见或稀少、致密或疏松、交织排列或平行排列、直径）；骨架菌丝（颜色、薄壁或厚壁或近实心、平直或弯曲、有无分枝、致密或疏松、交织排列或平行排列、直径）；囊状体或拟囊状体（有或无、形状、厚壁或薄壁、是否包被结晶、大小）；其他结构如刚毛、树状菌丝或菌丝钉等的有无，担孢子和拟担子的形状、颜色、厚壁或薄壁，表面光滑或有纹饰，在棉蓝试剂和Melzer试剂中的反应、大小、平均长、平均宽、长宽比等。综合宏观、微观特征并结合生态习性和腐朽类型等性状，查阅相关资料对采集的标本進行鉴定[4]。

1.4 ITS DNA鉴定在平板培养基上培养Fomitiporia yanbeiensis菌丝后，刮取50mg的菌丝，用CTAB的方法提取总DNA，抽提后分别用微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。采用通用引物ITS5（GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G）和 ITS4（TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC），对提取的真菌菌丝基因组ITS DNA进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性2min，重复95℃变性30sec，57℃复性1min，72℃延伸1min这变性—复性—延伸三个过程35个循环，最后在72℃保温10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

采用天根生化科技有限公司的胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，纯化产物进行sanger测序，将测序结果中质量较低的碱基剔除，同时将测得的ITS序列上传NCBI，对Fomitiporia yanbeiensis的ITS DNA进行Blast同源比对后，找到所分离菌株的同源性最高物种，并作为鉴定结果。

1.5 菌种培养基质实验采用三种培养基，观察菌丝生长情况。培养基成分：小麦、玉米、小米为主料，配以石膏粉和碳酸钙。小麦（玉米、小米）100：石膏粉25%：碳酸钙25%，即，主料2.5kg，拌入石膏粉25g，碳酸钙25g，搅拌均匀，调至含水量60%～65%，装袋，pH值自然。每袋装料250个左右。接种后观察菌种的生长状态。

2 结果与分析

2.1 形态鉴定及形态特征描述嗜蓝孢孔菌新种；见图1。

子实体：担子果7年多生，盖状无柄，有时平伏反卷生长，单生覆瓦状生，新鲜时无特殊气味，木栓质，干燥后木质。菌盖马蹄形，单个菌盖大约7cm长，4cm宽，2cm厚。菌盖上表面棕褐色，粗糙，无同心环带；菌盖边缘钝，黄褐色。菌盖背表面绿褐色，菌肉黄褐色，具同心的环区，木栓质，达30mm厚。菌管比菌肉颜色稍暗，棕黄色，木质，达10mm长（图1）。

菌丝结构：单系菌丝系统，生殖菌丝有锁状联合。骨架菌丝在Melzer试剂和棉蓝试剂中呈负反应；菌丝组织在氢氧化钾试剂中无反应，菌丝即不消解，也不膨胀。菌肉：生殖菌丝无色至浅黄色，薄壁至稍厚壁，偶尔分枝，直径为1.4～2.5μm。骨架菌丝占多数，黄褐色至锈褐色，厚壁且有一宽或窄的内腔，通常分枝，但不分隔，有时塌陷，交织排列，直径为1.7～3.2μm。

菌管：生殖菌丝占少数，无色，薄壁，偶尔分枝，直径为2～3μm；骨架菌丝占多数，黄褐色，厚壁，大致沿菌平行排列，直径为2.5～4.8μm。子实层中无刚毛和有囊状体，薄壁，大小为（4.6～8）μm×（3.8～4）μm；担子桶状或近球状，不着生担孢子梗，大小为（6～12）μm×（4～6.5）μm。拟担子少数，形状与担子相似，比担子稍小。

孢子：担孢子近球形或球形，无色，厚壁，平滑，在Melzer试剂中呈淀粉反应，在棉蓝试剂中其壁没有嗜蓝反应，大小为（4.0～5.1）μm×（5.4～6.1）μm，平均长为4.52μm，平均宽为4.18μm，长宽比约为1.08。

菌丝培养性状：培养的菌丝初期为白色，茸毛状，后期颜色逐渐变为浅黄色至黄色，菌丝变得较致密，毛毡状，菌落边缘的菌丝白色、稀疏，菌丝生长过程中形成的菌落没有明显的环带，在整个生长过程中菌丝无特殊气味，培养基的颜色不断发生变化，不产生子实体。在显微镜下观察，菌丝类型为单系菌丝系统，具有生殖菌丝和骨架菌丝（图2）。

2.2 ITS测序比对鉴定结果凝胶电泳结果显示得到了条带单一、大小较为一致的PCR结果，将PCR产物纯化后进行Sanger测序。将测序结果上传NCBI并获得检索登录号：KT861405.1。对所得到的序列进行Blast同源比对分析，发现与Fomitiporia yanbeiensis ITS DNA同源性最高的物种都是嗜蓝孢孔菌属的一些种类。

在本研究中，获得Fomitiporia yanbeiensis sp. nov. ITS序列片段长度789bp，在GenBank中经Blast检索比对，与Fomitiporia sp. HC-2016a和HC-2016b，GenBank： KU364417，KU364419，KU364420，KU364421，KU364422，KU364423等亲缘关系较近，这些菌株采自于中国西藏[11]，相似性为95%～96%。在GenBank经Blast检索比对的结果中，其他的Fomitiporia sp.都具有较大亲缘差距，相似性在91%以下。

2.3 菌种培养基质实验结果本实验采用了3种培养基质，接种新菌后30d和45d进行了菌丝生长状态调查，其结果见表1。

菌丝培养基质试验结果表明，接种后30d时，玉米基质中有70%长满菌袋，有20%菌丝超过1/2袋，只有5%的个体菌丝没有长满1/2袋。小麦培养基质中，有45%的个体长满了菌袋，30%菌丝超过1/2袋，25%的个体的菌丝没有长满1/2袋。这种新菌在小米培养基质中的生长状况最为不佳，当接种30d后没有一個菌袋长满菌丝，将一半（45%）的菌袋只长满了1/2左右。

当接种后菌丝生长到45d时，3种培养基质中的个体基本上都长满了菌袋，玉米95%，小麦90%，小米基质培养基为70%稍低一点，仍然有30%的个体未长满菌袋。

3 结论与讨论

嗜蓝孢孔菌属Fomitiporia是属于锈革孔菌科的一个属，目前报道包含有37个种[5]，在中国报道的有13个种[2]。嗜蓝孢孔菌属Fomitiporia sp.的担孢子是透明，厚壁状的，似糊精状的，嗜蓝色的，这一特征明显区别于针层孔菌Phellinus类真菌，最近的系统分类学研究表明嗜蓝孢孔菌属是锈革孔菌科中的一个独立的类群[6]。本研究标本Fomitiporia yanbeiensis sp.nov. 拥有Fomitiporia sp.的典型特征，如具有近球形或球形、透明的、厚壁担孢子，因此可以认为Fomitiporia yanbeiensis应归属于Fomitiporia.属的一个新种。

DNA条码技术是一个行之有效的生物鉴定手段，ITS序列分析被广泛应用于为微生物种类鉴定[7-8]。在本研究中，获得Fomitiporia yanbeiensis sp. nov. ITS序列片段长度789bp，在GenBank中经Blast检索比对，与Fomitiporia sp. HC-2016a和HC-2016b，GenBank： KU364417，KU364419，KU364420，KU364421，KU364422，KU364423等亲缘关系较近，这些菌株采自于中国西藏[9]，相似性为95%～96%。在GenBank经Blast检索比对的结果中，其他的Fomitiporia sp.都具有较大亲缘差距，相似性在为91%以下。

本研究报道的Fomitiporia yanbeiensis sp.nov.与Fomitiporia hippopha?icola （H. Jahn） Fiasson & Niemel? 具有相同種类的寄主植物——沙棘树，有较近的亲缘关系。Fomitiporia hippopha?icola采集于New York Botanical Garden，分离于沙棘腐木上，在中国也报道了西藏、青海、西北、内蒙古等地的沙棘树上有这个种生存[9-11]，与本研究中的Fomitiporia yanbeiensis sp.nov.具有相同的分离源，但是根据ITS序列分析，在GenBank的Blast比对结果表明，序列相似度只有88%[12]，这意味着两个类型可能不属于相同种类。再者，从形态学特征上看，Fomitiporia hippopha?icola 在子实体的假复层没有囊状体，菌肉灰褐色至深褐色，遇氢氧化钾变黑，二系菌丝系统，生殖菌丝无锁状联合，担子近球形至桶型，着生4个担孢子梗，担孢子在Melzer试剂中呈黄褐色（拟糊精反应），在棉蓝试剂中呈嗜蓝反应[13]，而Fomitiporia yanbeiensis子实体复层一侧膨出囊状体，单系菌丝系统，这是Fomitiporia hippopha?icola与Fomitiporia yanbeiensis的主要区别，此外Fomitiporia yanbeiensis的生殖菌丝有锁状联合，担孢子在Melzer试剂中变黑，具有淀粉质反应；菌丝在Melzer试剂中黄褐色，具有拟糊精反应，在5%氢氧化钾试剂中无任何变化，在棉蓝试剂中，担孢子、菌丝没有嗜蓝反应。因此本研究结论认为Fomitiporia yanbeiensis是属于Fomitiporia.属的一个新种。在山西北部地区沙棘树上发现有嗜蓝孢孔菌属的活标本，这对山西北部地区食用菌资源的研究填补了一项空白。

参考文献

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[5]Wikipedia. Fomitiporia [OL] https//en.wikipedia.org/wiki，2016-11-26.

[6]昝立峰. 粗毛纤孔菌与椭圆嗜蓝孢孔菌子实体的化学成分及其药理活性研究[D].长春：吉林农业大学，2012.

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[11]李玉，李泰辉，杨祝良，图力古尔，戴玉成. 中国大型菌物资源图鉴[M].郑州：中原农民出版社，2015：381-390.