通窍活血中药复方对体外培养视网膜Müller细胞在缺氧状态下细胞活力的影响

秦 伟，杨宇琦，陈一兵，翟 楠，王雪菁，王 炜，刘春兰，张 月，李 懿，曾东兴，刘 丹

(广州中医药大学附属中山医院，广东 中山528400)

通窍活血中药复方对体外培养视网膜Müller细胞在缺氧状态下细胞活力的影响

秦 伟，杨宇琦，陈一兵，翟 楠，王雪菁，王 炜，刘春兰，张 月，李 懿，曾东兴，刘 丹

(广州中医药大学附属中山医院，广东 中山528400)

目的 观察通窍活血中药复方对体外缺氧条件下视网膜Müller细胞活力的影响。方法采用SD大鼠制备通窍活血中药含药血清和空白血清，以终浓度为0.5 mmol/L的连二亚硫酸钠作为低缺氧组条件，以终浓度1 mmol/L的连二亚硫酸钠作为高缺氧组条件，将体外纯化培养的大鼠P2代视网膜Müller细胞分为6组，分别置于加入空白血清(正常对照组)、中药含药血清(正常中药干预组)、空白血清+低连二亚硫酸钠(低缺氧组)、空白血清+高连二亚硫酸钠(高缺氧组)、中药含药血清+低连二亚硫酸钠(低缺氧中药干预组)、中药含药血清+高连二亚硫酸钠(高缺氧中药干预组)的DMEM培养基中，培养48 h后比较各组乳酸脱氢酶(LDH)漏出量。结果低、高缺氧组较正常对照组LDH值明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。正常中药干预组LDH数值与正常对照组接近，差异无统计学意义(P＞0.05)。低、高缺氧中药干预组LDH漏出量均较对应的缺氧组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论缺氧条件可导致体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞膜稳定性下降，通透性增加，细胞活力降低，通窍活血中药含药血清可提高缺氧条件下视网膜Müller细胞活力，这可能是通窍活血中药复方对青光眼患者视神经保护的药物作用途径之一。

通窍活血;Müller细胞;缺氧;乳酸脱氢酶

青光眼是世界第二位致盲性眼病，是一组威胁和损害视神经视觉功能的临床症候群或眼病，主要与病理性眼压升高有关［1，2］。在我国，随着医疗知识的普及，青光眼诊疗水平的不断提高，青光眼患病率日益升高，给社会、家庭带来的生活经济负担难以估计。因此积极探索与研究如何防治青光眼患者视功能损害已成为眼科界研究的一个主要热点。机械学说和血流学说是青光眼视神经损害的两个传统学说。其中血流学说认为:除去高眼压之外视神经的持续缺血缺氧是导致青光眼患者视神经损害的另一重要因素。目前对高眼压条件下视网膜神经节细胞损害的研究较为广泛、深入，而对在缺氧条件下视网膜神经胶质细胞损害以及其与视网膜神经节细胞损害之间的关系的研究较少。视网膜Müller细胞是视网膜中一种最主要及最重要的神经胶质细胞，自外界膜纵向向内伸展，贯穿视网膜全层，包裹并串联起视网膜的各类神经细胞，对视网膜神经元细胞有营养支持作用，同时对维持视网膜稳定的内环境将起到至关重要的作用［3］。故而本实验旨在研究缺氧条件下通窍活血中药复方对视网膜Müller细胞活力的影响，已期开拓青光眼视神经保护的新方法新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

1.1.1 实验动物 大鼠视网膜Müller细胞体外培养用清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠10只，新生7天，雌雄不限。制备通窍活血中药复方含药血清用:清洁级SD大鼠50只，体质量150～180 g，8～12周龄，雌雄各半。两组动物由成都中医药大学实验动物中心提供(川实动管质第99-11号)。

1.1.2 药物及试剂 通窍活血中药复方(石菖蒲15 g、川芎 10 g、当归 10 g、丹参 10 g、郁金 10 g、桔梗5 g)由成都中医药大学附属医院中药房提供;连二亚硫酸钠(天津滨海科迪有限公司);谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)鉴定 I抗兔多克隆抗体(santa cruz，美国)，II抗生物素化羊克兔抗体(santa cruz，美国);乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂(Bio-Rad，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 中药含药血清制备［3～5］50只 SD大鼠按体质量分层随机分组分为通窍活血中药复方血清组(中药含药血清组)、空白对照组(空白血清组)两组，每组25只。中药含药血清组连续7天给予通窍活血中药复方浸膏，每日灌胃1次，每次10.87 g/kg;空白血清组给予等容量的生理盐水。末次给药后1小时，0.1%戊巴比妥1 ml腹膜下注射麻醉，腹主动脉采血于15 ml离心管，4℃冰箱静置，24小时，离心血清(3000 r/min)，56℃水浴箱，灭活后过滤除菌，分装于5 ml分装瓶，－20℃储存备用。

1.2.2 视网膜Müller细胞原代及传代培养及鉴定酶消化法体外纯化传代培养视网膜Müller细胞，GS免疫组化染色鉴定，实验细胞取用P2代细胞。具体方法同前期研究［4～6］

1.2.3 缺氧模型制备 以终浓度为0.5 mmol/L的连二亚硫酸钠作为低缺氧组条件，以终浓度1 mmol/L的连二亚硫酸钠作为高缺氧组条件，具体方法同前期研究［5，6］。

1.2.4 实验分组 将体外纯化培养的大鼠P2代视网膜Müller细胞分为6组。正常对照组:DMEM培养基，含20%空白血清;正常中药干预组:DMEM培养基，含20%中药含药血清;低缺氧组:DMEM培养基，含20%空白血清、终浓度为0.5 mmol/L的连二亚硫酸钠;低缺氧中药干预组:DMEM培养基，含20%中药血清、终浓度为0.5 mmol/L的连二亚硫酸钠;高缺氧组:DMEM培养基，含20%空白血清、终浓度为1 mmol/L的连二亚硫酸钠;高缺氧中药干预组:DMEM培养基，含20%中药血清、终浓度为1 mmol/L的连二亚硫酸钠。

1.2.5 视网膜Müller细胞LDH漏出量的测定 将密度为2×106/ml的P2代Müller细胞接种于48孔培养板，每孔400 μl;培养24 h，弃用含有血清的培养液，加入无血清的培养液，培养24 h，弃用无血清培养液，加入上述分组不同条件培养液，培养干预48 h;每孔收集培养基上清液50 μl，并快速加入LDH检测试剂(参照LDH试剂盒说明书操作)，使用490型酶标仪检测光密度D(440nm)的变化，计算LDH值。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行。定量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜Müller细胞鉴定结果纯化培养原代视网膜Müller细胞，革兰氏(GS)染色阳性率大于80%，表现为细胞浆内、细胞核见大量棕色阳性反应，稍浅的免疫阳性反应位于细胞周围，细胞轮廓表现为蹼形爪以及带有终足的扁平轮廓，纯化的P1代与P2代细胞GS染色阳性率达85%以上。见图1，图2。

图1 SD大鼠原代视网膜Müller细胞培养5 d后倒置显微镜像(×100)

图2 SD大鼠P2代视网膜Müller细胞培养5d后谷氨酰胺合成酶(GS)染色像(×200)

2.2 各组视网膜Müller细胞LDH漏出量比较低、高缺氧组较正常对照组LDH值明显升高，其差异有统计学意义(P＜0.05)。正常中药干预组LDH数值与正常对照组接近，差异无统计学意义(P＞0.05)。低、高缺氧中药干预组LDH漏出量均较对应的缺氧组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组视网膜Müller细胞LDH漏出量比较 (U/L)

3 讨论

早在《龙树菩萨眼论》、《秘传眼科龙木论》《太平圣惠方》等祖国医学传统医集中就有对青光眼的相关记载，青光眼属祖国传统医学中五风内障(绿风、青风、黄风、乌风、黑风)范畴。青光眼病位在瞳神及目系，多因五志过极，肝郁气结，肝失条达，气血淤滞，脉络不畅;或年老体弱，气血不足，气虚血瘀，玄府闭塞，目窍失养，神光难以发越，而致神经损害从而引起视力下降、视野缺损的相关病理表现。故青光眼的基本病机为气滞血瘀、气虚血瘀、玄府闭塞;治疗法则为益气活血、通窍明目、开启玄腑实。本研究选用石菖蒲、当归、川芎、郁金、丹参、桔梗组方:石菖蒲宁神益志、开窍醒神;当归补血活血，川芎行气活血为“血中之气药”，郁金凉血活血，行气开郁，丹参活血祛瘀，除烦安神，几药同用补血不滞，行血不破，补中有散，散中有收，佐助石菖蒲共济通窍活血之功，更佐桔梗宽胸行气，载药上行，开窍醒神，直达病位。

Müller细胞是视网膜中最主要的神经胶质细胞，它起至自外界膜，纵向伸展，贯穿整个视网膜直至内界膜，其胞体位于内核层，其突起与各种神经元细胞密切接触，并且参与形成视网膜内毛细血管的基底膜。Müller细胞及其突起沿着视网膜神经细胞分布，这种特征性排列就决定了Müller细胞将会更易于调节视网膜神经递质在细胞外的分布。Müller细胞除了起到视网膜支架及填充等被动作用外，还在视网膜微环境的调节中起到重要作用，与神经元有双向信号传递，并且可以表达各种电压门控型离子通道。这些都决定了在视网膜各种生理和病理过程中Müller细胞发挥着重要作用［7］。

细胞膜具有通透性，其通过选择性的控制物质进出细胞膜而控制细胞内外的物质交换，从而使细胞处于一个相对稳定的环境中。细胞代谢障碍，首要表现就是细胞膜的通透性发生障碍。乳酸脱氢酶(LDH)是一种活细胞内的特异性标志酶，正常状态下细胞外漏出量极少，病理状态下导致细胞膜通透性发生障碍，细胞外的LDH漏出量则显著增多，且细胞受损数量与LDH累计漏出量呈正相关［8］。可见，病理状态下细胞外LDH漏出量越多，则细胞膜越不稳定。因此，LDH细胞外释放量就可作为一个反映视网膜Müller细胞功能受损情况的敏感指标。本实验结果显示:低缺氧、高缺氧组较正常对照组LDH值明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示在缺氧条件下，体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞受损，细胞膜稳定性下降，通透性增加，活性减弱。

同时本实验结果显示，通窍活血中药复方含药血清对正常条件下体外纯化培养视网膜Müller细胞的LDH漏出量无明显影响(P＞0.05)，提示通窍活血中药复方含药血清对正常条件下视网膜Müller细胞的细胞活性无明显影响;加入中药干预缺氧组样本LDH漏出量较对应缺氧组未加中药干预样本的数值明显降低(P＜0.05)，提示通窍活血中药复方含药血清能明显降低缺氧条件下视网膜Müller细胞膜通透性、提高胞膜稳定性，从而减轻细胞损害，提高细胞活力。因此，笔者推测，通窍活血中药复方能提高青光眼患者视网膜Müller细胞细胞膜的稳定性，增强视网膜Müller细胞活力，这可能是通窍活血中药复方对青光眼患者视神经保护的药物作用途径之一。

［1］葛坚．眼科学［M］．2 版．北京:人民卫生出版社，2010:245．

［2］罗怀超，林婴，杨正林．原发性闭角型青光眼易感基因研究进展［J］．实用医院临床杂志，2016，13(2):158-162．

［3］Treins C，Giorgentti-peraloli S，Murdaca J，et al．Regulation of vascular endothelial growth factor expression by advanced glycation end products［J］．J Biol Chem，2001，276(47):43836-43841．

［4］谢学军，李芳梅，张梅，等．补肾活血法对Müller细胞谷氨酸摄取功能的影响［J］．中国中医眼科杂志，2008，18(1):19-22．

［5］秦伟，谢学军，李志英，等．补肾活血中药复方对AGEs及缺氧状态下体外纯化培养视网膜Müller细胞活力的影响［J］．中国中医眼科杂志，2016，26(4):215-218．

［6］秦伟，杨宇琦，翟楠，等．通窍活血方对体外培养的视网膜Müller细胞缺氧状态下谷氨酸摄取功能的影响［J］．中国中医眼科杂志，2016，48(1):77-79．

［7］李树宁．视网膜中的 Müller细胞［J］．眼科研究，2005，23(1):104-107．

［8］Kon JY，Choi DW．Quantitative determination of glutamate mediated cortival neuronnal injury in cell culture by lacatate dehyd rogenase ef-flux assaay［J］．Neurochem Meurochem Metheds，1987，20(1):83．

Effect of Tongqiao Huoxue Decoction on retinal Müller cells cultured in hypoxic condition

QIN Wei，YANG Yu-qi，CHEN Yi-bing，ZHAI Nan，WANG Xue-jing，WANG Wei，LIU Chun-lan，ZHANG Yue，LI Yi，ZENG Dong-xing，LIU Dan

Q3

B

1672-6170(2017)04-0226-03

2017-02-13;

2017-06-10)

广东省中医药管理局资助项目(编号:20122046);广东省中山市科技局资助项目(编号:20122A035)